微流控肺器官芯片的研究进展

谭剑峰，周成斌

呼吸系统疾病是导致全球残疾和死亡的主要原因[1]，其中慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是全球第三大死亡原因，有2亿中度至重度的COPD患者[2]。哮喘被认为是常见的慢性疾病，占全世界儿童总数的14%；肺炎也是5岁以下儿童死亡的主要原因；肺癌（包括气管和支气管癌）是最致命的癌症，每年导致160万人死亡[3]。为了解决这些问题，呼吸系统疾病在诊断和治疗方面迫切需要新的进展，微流控肺器官芯片模型（简称肺器官芯片）通过微流控通道来模拟气管或肺泡和血管，通过控制空气或流体的流速来模拟肺泡中气流的流速或血管中流体剪应力，精准模拟肺生理和病理条件，在人体肺生理、疾病病原学、毒理学研究和药物筛选等方面显示出了巨大潜力。

1 肺器官芯片的原理与制造

1.1 肺器官芯片的原理

肺器官芯片的主要原理是采用微加工的方法在聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）、聚碳酸酯（polycarbonate，PC）、聚苯乙烯（polystyrene，PS）或羊皮纸及各种生物材料制成的微型芯片上加工出特定形状的微结构，通常芯片上有上下两个微流控通道结构，上通道种植肺泡上皮细胞和提供氧气，形成气-液界面，模拟肺泡；下通道种植血管内皮细胞和连续灌注培养液，模拟毛细血管通道和流体剪切应力，中间由多孔薄膜将其分隔，模拟肺泡间隔；肺器官芯片的两侧存在侧室与两个真空泵相连，通过规律地改变侧室的压力，引起多孔薄膜规律的拉伸，模拟肺的呼吸运动，培养一段时间后细胞会形成具有功能的组织单元，该芯片便称为肺器官芯片[4～7]。见图1[5]。

1.2 肺器官芯片的制造材料

肺器官芯片的材料是其加工制造和应用的基础，常用材料有PDMS、纸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）等。其中应用最多的是PDMS，其组成成分包括预聚体和固化剂，先将两者按照一定比例进行混合，然后在常温或加热的条件下固化形成具有一定弹性的固体[8]。2010年哈佛大学Huh D等[5]首次制造肺器官芯片就是利用PDMS作为材料，之后研究者相继利用PDMS为材料制造了肺水肿微芯片[9]、肺癌微芯片[10]和肺血栓微芯片[11]等。PDMS的主要优点是无毒，透光性好，具有化学惰性，易于加工且成本低廉，因此被广泛应用于肺器官芯片的制造。但是PDMS材料的主要缺点是疏水，需要在其表面修饰一层生物兼容性较好的ECM或水凝胶材料，以促进细胞的贴壁生长[12，13]。另一缺陷是对疏水性药物有较高的吸收率，不能利用PDMS的肺器官芯片进行药物筛选[14]。Rahimi R等[4]使用由激光直接处理的羊皮纸作为一个有效的半透膜用于气-液界面细胞培养，构建了培养单层肺上皮细胞的理想、稳健且便宜的气-液界面。但是疏水的羊皮纸也存在缺点，其一是需要激光处理才能形成亲水性区域；其二长时间的体外培养会导致干湿抗张强度减弱，甚至有可能破坏半透膜。Li W[15]和Yang X等[16]利用PLGA纳米纤维膜制造肺器官芯片，PLGA纳米纤维膜具有良好的生物相容性和多孔性，利用纳米静电纺丝技术可以制备非常薄的膜（3μm左右）。然而PLGA材料强度不足，不能模拟流体剪应力和拉伸应力等生物物理因素。Zamprogno P等[17]利用胶原蛋白和弹性蛋白制成的生物、可拉伸和可降解膜的肺器官芯片，模拟了具有活体尺寸的微小肺泡阵列；这种膜在许多方面优于PDMS，不吸收疏水性药物，可生物降解，可以制备4μm左右的薄膜，是一种值得进一步研究的肺器官芯片材料。

1.3 肺器官芯片的制造技术

目前最经典的肺器官芯片制造技术是光刻技术，主要采用掩模板、光刻胶和紫外光等进行肺器官芯片微结构的成形。Huh D等[5]首先使用基于软光刻的微制造技术设计了PDMS肺器官芯片模型。Sellgren KL等[18]也利用光刻技术设计了另一种包含上皮细胞气道的微流控肺模型，这些细胞分别在气-液界面、肺成纤维细胞层和微血管内皮细胞层上培养，分别置于3个垂直堆叠的隔间中，每个隔间由纳米孔膜隔开。Stucki AO等[19]采用光刻技术创建了一个可逆性结合的肺泡-芯片模型来模拟肺实质的微环境，为了模拟体内的隔膜，他们使用了一个微隔膜来拉伸肺泡屏障。光刻技术的优势是工艺成熟，加工精度高，对于部分材料可达亚微米甚至纳米级。其缺陷是对加工材料种类有限制，通常是硅、玻璃材料及PDMS；另外光刻设备的费用比较昂贵，制造成本较高，一般医疗科研单位难以采用，多需联系外单位进行加工。

制造肺器官芯片的另一方法是模塑法，其原理是先利用光刻技术制备阳模，然后将液态的高分子材料倾倒至阳模表面，在重力、机械压力及电场力等驱动下，液态高分子材料填充至阳模的微结构中，最后将液体材料固化并脱模即得所需的肺器官芯片微结构[20～24]。Humayun M等[25]使用微研磨和溶剂黏合方法开发了肺器官芯片的热塑性模型，该芯片再现了肺气道微环境及平滑肌细胞、上皮细胞和支持ECM之间的相互作用。模塑法制造肺器官芯片往往需要与光刻技术相结合，由于模塑法中的阳模可重复使用，所以该方法的制造费用成本较低，可以用于批量化生产。

三维（three-dimensional，3D）打印技术也可以用于制造肺器官芯片。Park JY等[26]使用包含血管网络的3D细胞生物打印技术组装了一个气道芯片模型，使用聚己内酯、肺成纤维细胞生物墨水、内皮细胞生物墨水和PDMS开发了一个微芯片平台。Nawroth JC等[27]以PDMS为原料利用3D打印技术制造了人类气道肺器官芯片模型，首次展示了活的人类鼻病毒（human rhinovirus，HRV）感染哮喘上皮细胞，再现了病毒诱发哮喘加重的复杂特征。3D打印设备昂贵，制造成本高，对技术人员要求高，而且3D打印技术只能针对部分材料进行微纳米级打印，暂不适合批量化生产。

2 肺器官芯片在呼吸系统疾病中的应用

2.1 肺器官芯片用于肺部炎症研究

肺部炎症是指由细菌、真菌、纳米颗粒、免疫损伤、过敏原及药物等所致的终末气道、肺泡和肺间质的炎症。Huh D等[5]在肺器官芯片平台上利用肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）刺激上皮细胞可上调内皮细胞的细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）表达，激活的内皮细胞促进人中性粒细胞在血管微通道中黏附并穿透肺泡-毛细血管屏障；利用大肠杆菌刺激肺泡上皮细胞也会引起中性粒细胞在血管微通道中募集，中性粒细胞穿过肺泡-毛细血管屏障后到达内皮细胞层，吞噬大肠杆菌；利用二氧化硅（SiO2）纳米颗粒也会引起类似的炎症反应。此外，生理机械应变和SiO2纳米颗粒在上调ICAM-1表达和活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生有协同作用，呼吸运动的机械应变能显著增强由SiO2纳米材料导致的肺部炎症发生，这种效应与小鼠模型是一致的。

Zhang M等[28]构建了一种新颖的3D人体肺器官芯片模型来重建人体肺的器官水平结构和功能，纳米颗粒诱导肺上皮细胞和内皮细胞的毒性机制包括氧化应激、线粒体损伤、DNA损伤和炎症反应，随着炎症反应的加重，肺泡-毛细血管的屏障功能减弱，部分纳米颗粒可以穿过肺泡-毛细血管屏障并转移到其他器官。由此可见，肺器官芯片模型能够重现人体内病原微生物、炎性因子和纳米颗粒等引起的肺部炎症发生及免疫应答过程，为肺部炎症的研究提供了一个低成本的替代方案。

2.2 肺器官芯片用于支气管哮喘研究

支气管哮喘（bronchial asthma）是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症，与气道高反应性相关，常为广泛而多变的可逆性呼气气流受限。Benam KH等[29]开发了一种肺小气道芯片，微芯片支持分化的、黏液纤毛的细支气管上皮和底层的肺微血管内皮，而免疫细胞在底层流体中循环，被用于建模和研究哮喘和COPD的复杂过程，同时对治疗反应进行评估。用白细胞介素13（interleukin-13，IL-13）处理微芯片小气道时，杯状细胞数量明显增加和炎性细胞因子产生和分泌增加，纤毛跳动频率降低，这些都与哮喘患者气道黏膜表现类似[30～32]。

Nawroth JC等[27]利用3D打印技术制造类人类气道肺器官芯片模型，通过血管灌注IL-13来诱导Th2哮喘特征，并通过HRV-16感染上皮导致哮喘加重。首次利用肺器官芯片展示了活的HRV感染哮喘上皮细胞，动态微环境可以实时研究健康和哮喘条件下的病毒感染、上皮细胞反应和免疫细胞募集，再现了在哮喘患者和鼻病毒感染者中观察到的关键特点。

2.3 肺器官芯片用于肺癌研究

在全球范围内，肺癌是致死率最高的实体癌之一[33]，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌类型的85%[34]。尽管NSCLC经过多重方法的综合治疗，但是目前疗效欠佳，晚期NSCLC 5年生存率约15%[35，36]，严重威胁人类健康。Hassell BA等[10]建立了人类NSCLC的肺器官芯片模型，以研究不同微环境下的癌症行为、生长和侵袭变化。研究表明，NSCLC肿瘤细胞在人类肺泡芯片中增殖速度比在气道芯片中快得多，这些研究结果与肺腺癌患者体内的研究结果相似[37]。同时，该研究还证明了呼吸模式的循环机械应变的存在显著地抑制了肿瘤细胞的生长。此外，利用这个肺器官芯片模型来研究肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂的反应，结果表明呼吸运动抑制了NSCLC细胞对治疗的反应。

Yang X等[16]以PLGA静电纺丝纳米纤维膜为芯片衬底和细胞支架，制造了肺器官芯片。该芯片实现了3D培养，人NSCLC细胞系（A549）、人肺成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞多种细胞共培养，同时利用该模型来评估一种表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）靶向抗肿瘤药物（吉非替尼）的疗效。研究结果表明，人肺成纤维细胞1（human lung fibroblasts 1，HFL1）分泌的胰岛素样生长因子（insulin like growth factor-1，IGF-1）通过激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信号通路抑制EGFR相关通路，维持肿瘤细胞，这可能是肿瘤细胞对药物敏感性降低的一个原因。此外，他们发现A549可以通过引起内皮细胞凋亡或死亡导致肿瘤细胞侵袭。

3 药物研发与筛选

肺器官芯片在发现疾病的新机制、开发和筛选更安全、更有效地治疗呼吸系统疾病的药物方面有很大的潜力。例如Huh D等[9]进行肺水肿的机制研究，测试了一种药物，血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）来防止白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）诱导的血管渗漏。结果表明，当Ang-1与IL-2共施时，可以稳定内皮连接，完全阻止IL-2产生的血管渗漏；尽管仍存在有节律性的机械张力，它进一步防止了细胞旁间隙的形成。机械应变可激活香草酸受体4（transient receptor potential vanilloid，TRPV4）离子通道[38]。因此机械应变增加肺泡-毛细血管界面的通透性，导致肺内血管渗漏[39]。由GlaxoSmithKline公司合成的一种新开发的TRPV4通道阻断剂GSK2193874通过微血管通道注射，在循环机械应变存在的情况下，它抑制IL-2诱导的血管通透性。这些发现为肺水肿患者提供了可行的治疗方案。

当用于治疗类风湿性关节炎的Janus活化激酶（Janus activated kinase，JAK）抑制剂Tofacitinib在哮喘微芯片模型上测试时[40]，它逆转了IL-3诱导的哮喘变化。其Tofacitinib作用机制是抑制杯状细胞增生，粒细胞集落刺激因子和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子分泌减少，纤毛跳动频率恢复正常。而在IL-13暴露芯片中发现地塞米松治疗无效，这进一步支持了地塞米松吸入治疗不能缓解中重度哮喘患者症状的临床发现[41]。这些结果也有助于JAK抑制剂在过敏性气道疾病中的潜在应用[42]。

Xu Z等[43]开发一种基于肺器官芯片的3D共培养模型，用于检测肺癌药物敏感性，以实现肺癌个体化治疗。该装置培养了细胞系和/或原代细胞，并检测了它们对各种抗癌药物的敏感性；准确筛选与剂量相关的单药和联合抗肿瘤方案，以说明个体化治疗的范围。

4 问题与展望

尽管肺器官芯片得到一定程度的发展，但是同样面临如下挑战。第一、肺器官芯片制造最常用的材料是PDMS，存在吸收疏水性药物问题，限制了这种材料在制造用于药物发现和开发应用的器官芯片方面的用途，急需寻找更优的制造材料。第二、目前肺器官芯片的屏障膜厚度在10μm左右，而实际肺泡间隔厚度小于1μm，需要利用新材料和新方法制造超薄膜。第三、肺器官芯片中细胞种类太少，只包含整个器官细胞类型的一个子集，无法精准模拟肺部的微环境。第四、微米级的肺器官芯片，种植细胞较少，再加上持续灌注培养，存在稀释细胞产物的问题，检测和分析细胞产物面临挑战。第五、对于肺泡呼吸过程中的空气压力和流量的变化，目前仍无法精准模拟。第六、肺器官芯片需要PDMS层之间不可逆的永久结合，这使得获取、分离和处理用于某些类型分析（如组织学和电子显微镜）的微型设备中产生的完整人体组织在技术上具有挑战性。第七、获得具有增殖能力和完全分化能力的肺特异性细胞是另一挑战。

肺器官芯片的出现依赖于微制造技术和细胞体外培养技术的发展，作为一种新的方法，具有强大的应用潜力，旨在阐明复杂的病理生理学的肺疾病，并加快药物开发和药物筛选。随着肺部疾病和药物的社会和经济负担的增加，肺器官芯片有望成为一个蓬勃发展的平台，为个人识别新的和可能的最佳治疗方法，除了能改善患者的健康状况，也能减少了制药公司和研究人员对传统体外细胞培养和动物模型的依赖。相信随着科研人员的努力和新的制造技术发展，肺器官芯片将日趋完善，推动肺部疾病个性化治疗和药物的开发和筛选。