卵泡液miR-142-3p、TGF-β1水平预测体外受精-胚胎移植结局的价值

蒋伟民，李林江，孙少青，赵 星，江欣星

近年来辅助生殖技术有了长足进步，越来越多的不孕症患者接受体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization embryo transfer，IVF-ET）治疗，但妊娠率较低[1]。因此如何准确地预测IVF-ET结局至关重要。miR-142-3p在恶性肿瘤中差异表达，在血管内皮细胞增殖中发挥重要作用[2～4]。miR-142-3p可抑制HTR-8/SVneo细胞的增殖、侵袭等[5]。转化生长因子-β1（transforming gro-wth factor-β1，TGF-β1）能调控血管合成、卵泡液发育、受精和着床调控过程[6]。刘昕等[7]研究发现，TGF-β1通过高迁移率族蛋白组A1（homo sapiens high mobility group AT-hook 1，HMGA1）抑制滋养细胞的侵袭。但miR-142-3p、TGF-β1在卵泡液中表达情况尚无文献报道，与IVF-ET结局关系不明。基于此，笔者主要探讨miR-142-3p、TGF-β1在卵泡中表达水平及其对IVF-ET结局的影响，旨在提升IVF-ET妊娠成功率。

1 材料与方法

1.1 临床材料

选择海南现代妇女儿童医院2018年10月至2020年12月进行IVF-ET的100例不孕症患者，年龄28～41岁，平均年龄29.18岁（标准差4.09岁）；体质量指数（body mass index，BMI）18～26 kg/m2，平均BMI 23.11 kg/m2（标准差3.08 kg/m2）；不孕年限1～7年，平均不孕年限3.62年（标准差0.84年）。患者签定知情同意书，上报伦理委员会备案。

选择标准：符合不孕症诊断标准[8]；近期未使用免疫抑制剂、激素类药物；男方精液无异常。

排除标准：卵巢手术史；免疫系统疾病、传染及代谢病；配偶染色体异常；精神疾病；生殖器畸形。

1.2 方法

1.2.1 体外受精-胚胎移植方法

在B超引导下提取卵母细胞，然后与精子进行受精，继续孵育受精卵；取卵后48～72 h将分裂为4～8个细胞的早期胚胎移植入宫腔，注射黄体酮；2周后若尿妊娠试验阳性，继续注射黄体酮至10周停止。记录成熟卵细胞、受精及种植数。

1.2.2 卵泡液转化生长因子-β1水平检测

注射人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）36 h后收集卵泡液，于2 500 r/min条件下离心10 min，于-20℃冰箱保存。采用酶联免疫吸附分析试验盒（天津中奥天元生物有限公司，中国）检测TGF-β1水平。根据TGF-β1中位数分为高、低表达组。

1.2.3 卵泡液miR-142-3p水平检测

按miRNeasy Mini Kit提取分离试剂盒说明书进行miRNA提取，随后用分光光度计检测其浓度及纯度。按照cDNA合成试剂盒说明书合成cDNA，反应体系10μL：总RNA 7μL，5×Prime Script Buffer 2μL，Prime Script Enzyme Mix I 0.5μL，RT Primer 0.5μL，-20℃条件下保存备用。以U6作为内参，进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。反应体系总体积20μL：cDNA 4μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，PCR Forward Primer（10μmol/L）0.8μL，PCR Reverse Primer 0.8μL（10μmol/L），Rnase-Free Water 4.4μL。反应条件：95℃预变性10 min，95℃15 s，60℃60 s，共40个循环。结果使用2-ΔCt表示。

内参为U6。miR-142-3p引物：F 5＇-TGCGGCAACACC-AGTCGATGG-3＇，R 5＇-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3＇；U6引物：F 5＇-GGCTACAGCAACAGGGTG-3＇，R 5＇-TTTGGTTGAGCACAGGGT-3＇。根据miR-142-3p中位数分为高、低表达组。

1.2.4 临床妊娠评估

IVF-ET 4周后行阴道超声，若有孕囊则认定为临床妊娠。

1.3 统计学方法

利用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验或秩和检验；计数资料以百分数（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用受试者工作特性 （receiver operating characteristic，ROC）曲线评估miR-142-3p、TGF-β1对IVF-ET结局的预测价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外受精-胚胎移植结局

100例患者成熟卵细胞数、受精数、种植数分别为1 107个、1 011个、493个；获卵数、卵裂数、优质胚胎数分别为（17.84±1.34）个、（13.46±1.63）个、（4.01±0.47）个；妊娠48例（48.00%），未妊娠52例（52.00%）。

2.2 妊娠和未妊娠患者卵泡液miR-142-3p、TGFβ1水平比较

妊娠组卵泡液TGF-β1水平[（327.34±46.33）pg/mL]、miR-142-3p水平（0.36±0.01）低于未妊娠组患者[（478.12±53.06）pg/mL，1.02±0.14]，差异均有统计学意义（t=5.476、10.034，P=0.038、0.000）。见图1。

2.3 不同miR-142-3p、TGF-β1水平患者体外受精-胚胎移植结局比较

根据miR-142-3p、TGF-β1水平中位数（397.73pg/mL，0.71）分为低表达组、高表达组。低表达组患者获卵数、卵裂数、优质胚胎数、临床妊娠率均高于高表达组患者（P=0.000）。见表1、2。

表1 不同miR-142-3p水平患者IVF-ET结局比较Tab.1 Comparison of IVF-ET outcomes in patients with different miR-142-3p levels

表2 不同TGF-β1水平患者IVF-ET结局比较Tab.2 Comparison of IVF-ET outcomes in patients with different TGF-β1 level

2.4 卵泡液miR-142-3p、TGF-β1水平预测体外受精-胚胎移植结局的价值

miR-142-3p水平联合TGF-β1水平预测IVFET结局的ROC曲线下面积（area under curve，AUC）、灵敏度及特异度均高于miR-142-3p水平、TGF-β1水平单独预测。见表3、图2。

表3 卵泡液miR-142-3p、TGF-β1水平对IVF-ET结局的预测效能Tab.3 Predictive efficacy of miR-142-3p and TGF-β1 level in follicular fluid on outcomes of IVF-ET

3 讨论

近年来，中国不孕症发生率逐年升高，目前IVFET是治疗不孕症的最有效技术，但该技术的临床妊娠率只有50%左右，因此如何预测IVF-ET结局，从而提高妊娠率成为研究的热点。临床妊娠是一个复杂的过程，涉及胚胎、子宫内膜及内分泌等多种因素。截至目前，人们尝试使用年龄、窦卵泡计数（antral follicle counting，AFC）、可溶性人类白细胞抗原G（human leucocyte antigen-G，HLA-G）、抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）去预测IVF-ET临床结局，但结果差强人意[9～12]。卵泡液在促进卵泡成熟、精子运动，抑制透明带硬化等中发挥重要作用，卵泡液中一些生物化学指标可反映卵母细胞质量，影响胚胎发育。

有文献报道，TGF-β1可调控颗粒细胞生物学行为，干扰卵泡成熟[13]。此外，TGF-β1可用于预测IVFET结局[14]。笔者研究结果显示，低TGF-β1患者获卵数、卵裂数、优质胚胎数、临床妊娠率均高于高TGFβ1患者，提示TGF-β1影响了卵泡的发育，进而影响了IVF-ET妊娠结局，这与其他人的研究结果基本一致[14，15]。TGF-β1在细胞增殖、侵袭及血管生成中发挥重要作用，而卵泡膜可保证卵泡液TGF-β1含量较低，有利于卵母细胞成熟。

miRNA在颗粒细胞增殖、分化、性激素合成中发挥重要作用，与卵泡成熟度有关[16～18]。miR-142-3p位于人染色体19q13.42，参与多种肿瘤细胞的生物学行为。文献报道[19]，miR-142-3p可靶向FOXM1调控滋养层细胞生物学功能。笔者研究结果显示，低mi R-142-3p患者获卵数、卵裂数、优质胚胎数、临床妊娠率均高于高miR-142-3p患者，提示mi R-142-3p影响了卵泡的发育，进而影响了IVF-ET妊娠结局。但miR-142-3p影响妊娠结局的机制有待进一步体外实验验证。

卵泡液TGF-β1、miR-142-3p水平与IVF-ET结局关系不详。笔者研究结果显示，妊娠者两者浓度低于未妊娠者，且ROC曲线显示，它们均可预测IVFET结局，特别是两者联合检测预测价值更高。

综上所述，卵泡液TGF-β1、mi R-142-3p水平可预测IVF-ET结局，但笔者研究数据有待进一步大样本验证。