黄芪内生菌多样性及其次生代谢产物研究进展

任群利， 王 苗， 李小兰， 胡 欢， 刘建国， 冉应会， 綦 杉， 王 倩

（1.遵义医科大学生命科学研究院 贵州省普通高等学校微生物资源与药物开发特色重点实验室，贵州遵义 563000；2.遵义医科大学生命科学研究院 贵州省普通高等学校口腔疾病研究特色重点实验室，贵州遵义 563000；3.遵义医科大学基础医学院，贵州遵义 563000；4.遵义医科大学第一临床学院，贵州遵义 563000）

黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根（国药典，2020）。 黄芪又称黄耆、戴糁、绵芪、芰草、百木、箭芪，主要分布在中国和韩国（Jin-Hee，2017） ，在我国主要分布于东北、西北和内蒙古等地（翟李欣，2019；张开雪，2016），是重要的北方药材， 药用价值具有2000 多年的历史 （张雷鸣，2014）。 黄芪中含有多种生物活性成分， 如多糖、皂苷、黄酮、氨基酸、谷甾醇、β 素谷甾醇、亚麻酸、亚油酸、叶酸及多种微量元素等，潜在质量标志物为黄芪甲苷、 毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷 （姜辉，2020）。 黄芪具有强心、抗心肌缺血、提高免疫力、降糖、抗衰老、保护脏器等多种药理作用（张淑娟，2021；张开雪，2016）。

植物内生菌（Endophyte）是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌。 植物内生菌是具有丰富多样性特征的微生物类群，据统计，自然界中至少存在着一百万种内生菌（Radic，2012），植物内生菌是一种新型生物活性物质资源（翟李欣，2019），以宿主植物代谢物为营养物质（高红，2020）。内生菌能够产生与宿主相同或相近的活性成分物质， 已经被证实是一类丰富代谢产物的重要来源（Schulz，2002）。 随着测序技术不断提升， 对黄芪内生菌的开发研究逐渐增加，本文就近年来对黄芪内生菌多样性、内生菌的分离鉴定及其次生代谢产物的研究进行综述。

1 黄芪内生菌多样性

黄芪内生菌包括真菌和细菌。 内生菌的多样性主要由以下几个方面决定:（1）同种植物的不同部位，如根、茎、叶，在其组织内所生长的内生菌的种类及数目不同 （Subhash Janardhan，2012）；（2）同种植物在不同生理、病理状态下，其内生菌种类及数目也会相应发生改变（郑雪，2017）；（3）产地、气候等环境因素及采集的时间等都直接影响内生菌生物多样性（Brader，2014；Yang，2012；潘巧娜，

2008）。本文对黄芪内生菌多样性研究进行全面归纳总结，文献中黄芪主要采自其主产地黑龙江、山西、内蒙古、青海、辽宁、哈尔滨及甘肃等地，均为健康植株，多数为野生黄芪。

1.1 黄芪内生真菌多样性 植物内生真菌（Endophytic fungi） 是指那些寄生全部生活或近乎全部生活于健康植物的各种组织和器官内部或细胞间隙中，而不使寄主表现任何症状的一类真菌（张雷鸣，2014；周凤，2012） 。赵春杰等（2009）从黄芪根部分离得到了12 株内生真菌，5 株内生真菌的菌块有抑菌活性。 马伟等（2012）从黄芪根块中共分离出28 株内生真菌， 分属于镰孢菌属（Fusarium），生赤壳属（Bionectria），裸胞壳属（Emericella），枝穂霉属（Cladosporium），枝顶孢属（Acremonium）， 青 霉 属 （Penicillium） 及 曲 霉 属（Aspergillus）。 周凤等（2012）从恒山黄芪根、茎、叶中共获得49 株内生真菌， 分属于3 目、6 科、17 属，从黄芪的根部分离得到28 株内生真菌， 分属于11 个属，丝核菌属（Rhizoctonia）和根霉属（Rhizopus）为优势属，茎中分离出15 株内生真菌，分属于9 个属，丝核菌属为优势属，而叶中只分离出6株内生真菌，33 株具有抑菌活性，9 株高抗菌活性的菌株。龚贺等（2014）从膜荚黄芪根、叶各培养基上共分离65 株内生真菌， 鉴定为半知菌门镰孢属、曲霉属、青霉属，其中镰孢属为优势菌群。Wei Ma（2014）对东北地区黄芪内生真菌活性物质生产进行研究， 从黄芪中共分离到28 株内生真菌。胡青等（2016）从黄芪块根中得到内生真菌17 株，分列7 个菌属中。 孔悦等（2016）从黄芪的根、茎、叶中分离出20 株内生真菌， 有8 株抑菌率较大。郑雪等（2017）从北芪根部、茎部中共分离出30 株内生真菌，从根中分离得到16 株，从茎中分离得到14 株。刘蓬蓬等（2018）分离鉴定黄芪根部内生真菌主要分布于驼孢锈菌属（Hemileia），赤霉菌属（Gibberella），粪盘菌属（Ascobolus），假裸囊菌属（Pseudogymnoascus） 和曲霉属共5 个属，刘超等（2019）从黄芪植株研究中得到相同结论，其优势菌属为驼孢锈菌属和赤霉菌属。

1.2 黄芪内生细菌多样性 内生细菌（Endophyt e）是指广泛存在于一切植物体内的共生细菌，研究者从黄芪中发现大量内生细菌存在。 赵春杰（2009）从黄芪中分离出内生细菌8 株，经复筛后有3 株具有抗菌活性。马芸（2010）对我国青藏高原药用植物党参、黄芪、连翘叶片的内生细菌进行遗传多样性的研究，共分离到42 株内生细菌，分属于9 个属，其中微球菌属（Micrococcus）为此类群的优势菌群。胡青（2016）从黄芪中分离到内生细菌34 株，革兰氏阳性菌19 株、革兰氏阴性菌15 株，以单胞杆菌和芽孢杆菌属为主。刘蓬蓬等（2018）从黄芪内生细菌门的分类水平看，主要分布在变形菌门（Proteobacteria），厚壁菌门（Firmicutes）， 拟杆菌门 （Bacteroidetes）， 浮霉菌门（Planctomycetes），放线菌门（Actinobacteria）。 属水平上主要分布于Anderseniella 属，芽孢杆菌属（Bacillus），伯克氏菌属（Burkholderia），不动杆菌属 （Acinetobacter）， 寡 养 单 孢 菌 属（Stenotrophomonas）， 海 洋 芽 孢 杆 菌 属（Oceanobacillus）6 个属。 翟李欣等（2019）从北芪根部、茎部共分离出36 株内生细菌，根中20 株，茎中16 株。 研究表明，黄芪根部共分离得85 株内生细菌，分属4 个门和13 个属，在门水平，主要为变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、杆菌门，属水平上，主要分布为泛菌属、单胞菌属、葡萄球菌属（高红，2020）。

2 黄芪内生菌分离鉴定及活性研究

药用植物内生菌与药用植物本身一样， 具有某些抗药抑菌活性（马芸，2010）。孙月等（2006）从膜荚黄芪叶中分离到一株具有抗菌活性的内生真菌-瓶霉菌属（Phialophora）。 赵春杰等（2010）从黄芪植物中分离到一株具有高抑菌活性的菌株，鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilius）的变种。 翟李欣等（2019）从黄芪根、茎中发现一株内生细菌，鉴定为甲基营养型芽孢杆菌 （Bacillus methylotrophicus）。 周凤等（2012）从中国药用植物恒山黄芪的根部分离得到一株内生真菌， 鉴定为曲霉属；Ma（2014）从黄芪中分离出四株生长稳定，活力旺盛， 重复性好的菌株， 鉴定为Oxysporum和Bionectria ochroleuca， 这两种内生真菌在中国东北地区鲜见分离报道。 张宏驰等（2017）从黄芪茎部分离得到一株内生真菌，鉴定为青霉属；从黄芪根部分离到的一株内生真菌，被鉴定为根霉属；从黄芪叶部分分离出一株内生真菌， 鉴定为溜曲霉（Aspergillus tamarii），该菌具有降解甲醛作用。 刘瑞等（2019、2016）从黄芪根部发现了3 株内生真菌，2 株鉴定为刀孢蜡蚧菌（Lecanicillium psalliotae）和灰黄青霉（Penicillium griseofulvum），该菌株对皮革霉变真菌有很好抑制作用；1 株真菌鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）；郑雪等（2017）从黄芪中发现一株内生真菌， 鉴定为链格孢属菌（Alternaria alternata）。 孔悦等（2016）筛选出2 株恒山黄芪内生真菌头孢霉属 （Cephalosporium）和青霉属，对指示菌有很强的抑菌活性。 研究表明，黄芪叶片中的两种内生真菌，Diaporthe oncostoma和Diaporthe infecunda，被用作强心剂、利尿剂和血管扩张剂（Jin-Hee，2017）。

3 黄芪内生菌次生代谢产物及活性

内生菌能够产生与宿主相同或相近的活性成分物质， 已经被证实是一类丰富代谢产物的重要来源，是筛选活性物质的潜在资源。植物内生菌活性代谢产物的多样性由其宿主植物中内生菌的多样性所决定， 研究表明黄芪内生菌次生代谢产物中含有皂甙类、多糖类和黄酮类物质，对细菌具有不同程度的抑菌活性（孙月，2006），除此之外，还含有氨基酸和生物碱类物质等重要活性成分（潘巧娜，2008）。

3.1 黄酮类 郑雪等（2017）研究发现，1 株黄芪内生真菌链格孢属菌发酵产物为活性成分芒柄花素（formononetin），翟李欣等（2019）从2 株内生细菌发酵产物中发现了该化合物。

3.2 生物碱

3.2.1 gliotoxin 类 刘瑞等（2016）从黄芪内生真菌发酵液中分离鉴定出活性次生代谢产物gliotoxin 类共7 个，其中从灰黄青霉和青霉属（张弘弛，2017） 的发酵液中分离鉴定出胶霉毒素gliotoxin，从青霉属的固体发酵萃取物中分离到6个 gliotoxin 类 代 谢 产 物 为 bisdethiobis（methylthio） gliotoxin，dehydroxybisdethiobis（methylthio） gliotoxin，dehydrogliotoxin，6-deoxy-5a，6 -didehydrogliot oxin，didehydrobisdethiobis（methylthio）gliotoxin，bis-N-norgliovietin， 其中一类化合物主要用作免疫抑制剂，具有抗病毒、抗真菌和抑菌作用， 对黄芪白粉病原菌显示出强抑制作用， 另一类化合物物具有拮抗血小板激活因子的活性（张弘弛，2017）。

3.2.2 吲哚二酮哌嗪类 周凤（2012）从恒山黄芪一株内生真菌曲霉属的发酵液中分离得到4 个吲哚二酮哌嗪类代谢产物，分别为fumitremorgin B，verruculogen，fumitremorgin C 和cyclotryprostatins B。 抗菌活性显示，4 个化合物对大部分测试菌均具有明显的抑制活性， 特别是化合物yclotryprostatins B 显示出很强的抑制真菌的活性。 张弘弛等（2017）从黄芪内生真菌青霉属发酵液中分离到化 合 物 fumitremorgin B，verruculogen 和 cyclotryprostatins B， 还分离到其他5 个吲哚二酮哌嗪类生物碱，分别鉴定为tryprostatin B，tryprostatin A，cyclotryprostatin A，cyclotryprostatin C，cyclotryprostatins D。 所有吲哚二酮哌嗪对黄芪白粉病原菌都显示出一定的抑制作用， 化合物cyclotryprostatins A 和cyclotryprostatins C 是 首 次 从恒山黄芪内生真菌灰黄青霉的发酵液中分离到的， 被认为具有不同程度的抗肿瘤活性 （刘瑞，2016）。

3.2.3 fumiquinazoline 类 目前， 从黄芪内生菌发酵产物中分离得到fumiquinazoline 类生物碱共7 个，刘瑞等（2016）从内生真菌灰黄青霉的发酵液中分离得到fumiquinazoline D、fumiquinazoline J 和fumiquinazoline H；安志鹏等（2016）从曲霉属发酵液中分离得到化合物fumiquinazoline D，fumiquinazoline J，fumiquinazoline H，fumiquinazoline I，fumiquinazoline C， fumiquinazoline B。 张宏驰等（2017）从黄芪根部真菌刀孢蜡蚧菌的发酵代谢物中分离到fumiquinazoline C 和fumiquinazoline A。fumiquinazoline D 和fumiquinazoline J 具 有 不 同程度的抗肿瘤活性，fumiquinazoline J 和fumiquinazoline H 具有抑制皮革霉变真菌的活性，fumiquinazoline I 和fumiquinazoline H 是 首 次 从植物内生真菌中分离得到。

3.2.4 其他生物碱 张弘弛等（2017）从恒山黄芪根部的内生真菌根霉属发酵液中分离得到色胺酮tryptanthrin，曲菌酸（kojic acid），从黄芪内生菌刀孢蜡蚧菌发酵代谢物中分离到尿囊素（allantoin），色胺酮是一种喹唑啉酮生物碱， 主要被用来治疗刀伤、溃烂、蛇咬、痔疮及各种炎症，曲菌酸是一种黑色素专属性抑制剂。

3.3 甾体类 周凤等（2012）从恒山黄芪一株内生真菌曲霉属的发酵液中分离得到2 个甾体化合物啤酒甾醇（cerevisterol）和过氧化麦角甾醇（ergosterol peroxide） 。 刘瑞等（2016）从恒山黄芪内生真菌灰黄青霉的发酵液中分离得到2 个甾体化合物为23-甲基麦角甾-7，22-二烯-3β，5α ，6α-三醇 （23-methylergosta-7，22-diene-3β，5α，6αtriol） 和5α，8α－表二氧麦角甾－6，9 （11），22－三烯－3β－醇（5α，8α-epidioxy-ergosta-6，9（11），22-trien-3β-ol）。 张宏驰等（2017）从刀孢蜡蚧菌的发酵代谢物中分离到2 个拮抗皮革霉变的甾体化合物， 分别是过氧化麦角甾醇和麦角甾醇（ergosterol）。刘瑞等（2019）从黄芪中内生真菌黑曲霉发酵液中得到9 个甾醇类代谢产物化合物。 分别为啤酒甾醇、 过氧化麦角甾醇、23－甲基麦角甾－7，22－二烯－3β，5α，9α－三醇、5α，8α－表二氧麦角甾－6，9（11） ，22－三烯－3β－醇、麦角甾醇、胆固醇（cholesterol）、5α，8α－表二氧－23－甲基麦角甾－6，22－二烯－3β－醇 （5α，8α- epidioxo-23-methylergostane-6，22-dien-3β–ol）、 麦 角 甾－4，6，8（14），22－四烯－3－酮（ergostane-4，6，8 （14），22-tetraene-3-one）、3β，5α－二羟基麦角甾－7，22－二烯－6－酮 （3β，5α-dihydroxyergostane-7，22-dien-6-one）。此外，从黄芪根部的内生真菌根霉属发酵产物中发现了lawsaritol A（张弘弛，2017），在扁茎黄芪植株中同样发现（薛利娟，2019）。 β-谷甾醇（β-sitosterol） 具有抗氧化和抗动脉粥样硬化作用、抗炎和解热活性、驱虫和抗突变活性、免疫调节活性（Wang，2016）。

3.4 醌类 刘瑞等（2016）首次从恒山黄芪内生真菌灰黄青霉、 根霉属和刀孢蜡蚧菌 （张弘弛，2017） 的发酵液中分离得到醌类次生代谢产物monomethylsulochrin 和杀锥曲菌素素（trypacidin），从根霉属中发现了蒽醌类大黄素-8-甲醚（emodin 8-O-methylether），杀锥曲菌素是一种特异杀菌剂， 黄素-8-甲醚对多种细菌均有抑制作用，对人体宫颈癌HeLa 细胞也有抑制作用。

3.5 肽类 张宏驰等（2017）从黄芪根部内生真菌曲霉属的固体发酵物中分离到8 个环二肽化合物，分别为环（脯-甘）二肽（cyclo-（Pro-Gly）），环（脯-亮）二肽（cyclo-（Pro-Leu）），环（脯-异亮）二肽（cyclo-（Pro-Ile）），环（脯-缬）二 肽（cyclo-（Pro-Val））， 环 （苯丙-甘） 二肽 （cyclo-（Phe-Gly）），环（苯丙-丙）二肽（cyclo-（Phe-Ala）），环（苯丙-络）二（cyclo-（Pro-Tyr））肽和环（苯丙-脯）二肽（cyclo-（Pro-Phe）），大部分环二肽化合物已被发现具有很好的生物活性。

3.6 内酯类 张弘弛等（2017）从恒山黄芪根部的内生真菌根霉属固体发酵产物中发现了1 个内酯类次生代谢产物cannabifolactone A。 cannabifolactone A 被发现可以作为流感病毒核酸内切酶PAN 抑制剂（Wu，2002），张影珍等（2015）从真菌的发酵物中也分离得到。

4 总结

植物内生菌及其代谢产物具有与植物化学成分相同活性的作用。研究表明，黄芪内生菌具有种类丰富多样的生物多样性，黄芪根、茎、叶中内生菌种类丰富多样， 具有很好的研究和应用价值。目前已分离鉴定出多株活性内生菌， 内生菌发酵代谢产物主要包括生物碱、多肽类、甾体类、蒽醌类和内酯类等化合物，而黄芪皂苷类、黄芪多糖类和黄芪黄酮类检出较少，可能是黄芪来源、采摘时间、预处理等多种干扰因素造成（马伟，2012）。 研究表明， 黄芪内生菌具有与植物成分相似药理作用，具有抑菌杀菌、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤的抗炎等作用，有望成为各种疾病综合防治的备选资源。近年来，随着药用植物内生菌活性成分的挖掘，中草药内生菌的研究逐渐增多，例如黄精、石斛、天麻、艾蒿、白芨、鬼针草、竹节参等内生菌都有一定研究，但部分药材内生菌研究较少，尚处于起步阶段，内生菌活性利用欠佳，药用植物内生菌具有很好的开发运用价值， 其更多活性作用丞待进一步研究。 本文对黄芪内生菌多样性及其次生代谢产物进行综述，以期为药材进一步研究提供思考，为后续实验指明方向， 建议可从内生菌次生代谢方面着手， 为更多药用植物内生菌的开发利用提供线索，以内生菌作为新的活性资源，在一定程度上为解决临床药物来源以及农作物的生物综合防治等提供新的思路。