调节性T细胞及调节性B细胞在成人原发免疫性血小板减少症中的表达研究

傅磊 李亮 卞建军 沈磊 苏玉璇 左金曼

成人原发免疫性PLT减少症(ITP)曾称特发性PLT减少性紫癜，是一种由自身抗体介导，以PLT破坏增加及生成减少为特征的获得性自身免疫性出血性疾病[1-2]。ITP患者存在体液免疫功能异常，亦存在细胞免疫功能异常，特别是调节性T细胞(Treg细胞)、调节性B细胞(Breg细胞)的数量和(或)功能异常在疾病发生发展中起到十分重要的作用[3]。本文应用流式细胞术检测成年ITP患者治疗前后Treg细胞、Breg细胞水平变化，并与正常人进行比较，旨在了解ITP患者细胞免疫功能异常情况，为其治疗提供方向。

对象与方法

1.对象：2017年1月～2020年6月于我科门诊就诊及住院的ITP患者82例(ITP组)，其中男45例，女37例，年龄16～72岁，平均年龄(44.52±11.26)岁，发病时平均PLT计数(10.25±6.32)×109/L。ITP诊断标准参照《成人原发免疫性PLT减少症诊断与治疗中国专家共识(2016年版)》[4]。排除标准：(1)其他自身免疫性疾病继发PLT减少；(2)颅内出血；(3)严重血栓病史；(4)严重肝、肾功能不全或心、肺功能障碍；(5)忌用糖皮质激素；(6)妊娠或哺乳期。纳入同期于我院体检的健康者45例(对照组)，其中男25例，女20例，年龄19～65岁，平均年龄(43.78±10.59)岁。所有对照组受试者均已排除自身免疫性疾病和过敏性疾病史者。两组受试者性别、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经过我院伦理委员会审核批准，所有受试者均知情同意。

2.方法

(1)一般资料收集：收集所有受试者的一般资料，包括年龄、性别。收集ITP患者发病时的PLT计数。

(2)治疗方案：根据治疗方案将82例ITP患者分为地塞米松组(地塞米松单药治疗，10例)和地塞米松+重组人PLT生成素(rhTPO)组(地塞米松联合rhTPO治疗，72例)。地塞米松单药治疗方案：地塞米松40 mg，每日1次静脉滴注，共4日。地塞米松联合rhTPO治疗方案：地塞米松40 mg，每日1次静脉滴注，共4日；rhTPO 15 000 U，每日1次皮下注射(PLT计数≥100×109/L时停用，最多应用14日)。

(3)疗效判断：参照《成人原发免疫性PLT减少症诊断与治疗中国专家共识(2016年版)》[4]，疗效包括完全反应(CR)、有效(R)及无效(NR)，治疗有效例数=CR例数+R例数。根据疗效将82例ITP患者分为治疗有效组(75例)和治疗无效组(7例)。

(4)Treg细胞及Breg细胞水平检测：所有治疗有效患者均在治疗前、后留取血液样本，治疗无效患者在治疗开始后4周留取血液样本，对照组受试者于体检时留取血液样本。加入不同抗体采用FACSCantoⅡ流式细胞仪(BD公司，美国)，应用BD Cell Quest软件分析实验数据，分别记录CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞及CD19+CD24highCD38highBreg细胞水平。

结 果

1.ITP患者治疗后的临床疗效：82例ITP患者中地塞米松单药治疗10例，地塞米松联合rhTPO治疗72例。见表1。两种方案治疗后共75例有效(包括63例CR和12例R)，7例无效，总有效率为91.46%(75/82)。

表1 ITP患者治疗后的临床疗效(例)

2.ITP组治疗前和对照组受试者两种细胞水平比较：ITP组治疗前CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞及CD19+CD24highCD38highBreg细胞水平均明显低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 ITP组治疗前和对照组受试者两种细胞水平比较

3.治疗有效组和治疗无效组患者治疗前后两种细胞水平比较：治疗前两组患者CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞及CD19+CD24highCD38highBreg细胞水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗后治疗有效组患者两种细胞水平均高于同组治疗前及同期治疗无效组(P<0.05)，治疗无效组患者治疗前后两种细胞水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 治疗有效组和治疗无效组患者治疗前后两种细胞水平比较

讨 论

ITP是一种临床常见出血性疾病，原因为各种免疫介导而致患者PLT过度破坏、PLT生成减少，引起发病[5]。T细胞及B细胞水平异常及功能改变在多种自身免疫性疾病中均起到重要作用。Treg细胞、Breg细胞具有低反应性及免疫抑制性，通过独特的免疫调节作用，可诱导和维持机体的自身免疫耐受。Treg细胞可高表达CD25，分泌IL-10及转化生长因子(TGF)-β等多种细胞因子，并表达特异性的FOXP3转录因子，因此CD4+CD25+FOXP3+是最经典的Treg细胞免疫表型，此类Treg细胞可通过抑制T细胞的活化及自身反应性T细胞的免疫反应，进而促进抑制性细胞因子的分泌等作用，维持外周免疫耐受，可参与多种变态反应性疾病及肿瘤免疫的发病[6-7]。Breg细胞是另一类具有独特免疫调节作用的B细胞亚群[8]，可分泌IL-35、IL-10及TGF-β等细胞因子，参与自身免疫性疾病、慢性感染性疾病、恶性肿瘤及过敏性疾病等多种疾病的免疫反应。Breg细胞的常见表型有CD19+CD24highCD38high、CD19+CD24highCD27+、CD19+CD25highCD71high、CD19+CD24+FOXP3+等，目前研究最多的是CD19+CD24highCD38highBreg细胞。

Treg细胞减少及其功能缺陷会引起多种自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎等[9-10]。ITP作为一种十分常见的自身免疫性疾病，越来越多的研究开始探讨其发生、发展进程中Treg细胞发挥的作用。现有研究表明，ITP患者外周血及脾脏中的Treg细胞水平均明显下降[11-12]。还有学者发现Treg细胞在ITP患者中不仅存在水平减少，还有功能的下降，其伴随增殖相关蛋白水平下降和细胞自噬功能降低，从而参与疾病的发生及发展[13]。有学者通过检测ITP患者体内Treg细胞全基因组微小RNA(miRNA，miR)表达谱，发现其中miR-155-5p、miR-146b-5p和miR-142-3p的表达较对照组显著降低，推测在ITP患者中miRNAs的低表达可能影响Treg细胞的功能[14]。本研究检测ITP患者外周血中CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞水平，结果显示，与对照组比较，ITP患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞水平明显降低，与上述研究结果一致，提示Treg水平减少可能是影响ITP疾病发生发展的重要因素。有研究进一步证明，ITP患者Treg细胞水平在进行糖皮质激素治疗前明显低于正常人，但治疗后Treg细胞水平明显升高[15]。特别是经大剂量地塞米松治疗后，ITP患者Treg细胞数量明显升高，PLT水平迅速恢复[16]。Sakakura等[17]研究也发现，ITP患者在进行相关治疗后处于完全缓解期时，特别是在脾脏切除术后，其Treg细胞水平明显升高。另有学者通过系列针对成人和儿童ITP患者的研究发现，Treg细胞在外周血、骨髓和脾脏中的水平均显著降低，Treg细胞功能明显受损；在经地塞米松、利妥昔单抗或PLT生成素受体激动剂等方案治疗后，Treg细胞失调情况得以改善，PLT水平恢复[18]。本研究所有ITP患者在地塞米松单药或联合rhTPO治疗方案治疗后，治疗有效组患者CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞水平较同组治疗前明显升高，而治疗无效组该细胞水平较同组治疗前无明显升高，提示ITP患者Treg细胞水平异常可能参与疾病发展。

Breg细胞水平减少及功能缺陷可参与SLE、再生障碍性贫血等多种自身免疫性疾病的发展过程[19-20]。目前Breg细胞在ITP中的作用得到越来越多的研究证实。研究发现，ITP患者体内Breg细胞水平明显下降，并可通过调节体液免疫影响IL-10及TGF-β等细胞因子的表达，使患者Breg细胞功能下降[21-22]。本研究发现ITP患者外周血CD19+CD24highCD38highBreg细胞水平明显低于对照组，与上述研究结果一致，提示Breg细胞水平减少可能是ITP发病的重要因素。相关研究显示，ITP患者应用地塞米松治疗后，体内Breg细胞水平升高，并促进IL-10的分泌增加，疗效显著[22]。另有学者通过应用rhTPO联合沙利度胺方案治疗难治性ITP患者发现，加用rhTPO后患者Breg细胞和Treg细胞水平均显著升高，总缓解率明显提高[23]。本研究中，ITP患者应用地塞米松单药或联合rhTPO方案经有效治疗后CD19+CD24highCD38highBreg细胞水平明显恢复，而治疗无效者该细胞水平无明显变化，提示Breg细胞水平异常可能参与ITP患者的疾病发展。

本研究发现ITP患者体内CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞及CD19+CD24highCD38highBreg细胞水平较对照组明显下降，经有效治疗后两者细胞水平显著升高，治疗无效时则无明显变化，提示Treg细胞及Breg细胞可能参与ITP的发生和发展。其可能机制是患者体内Treg细胞、Breg细胞水平的减少无法有效抑制免疫作用，使细胞免疫抑制功能出现缺陷，并导致各种细胞因子分泌下降，打破自身免疫平衡，最终引起自身反应性T细胞、B细胞激活增多，导致PLT大量破坏。而经过免疫抑制和(或)促PLT生成药物治疗后，患者Treg细胞、Breg细胞水平升高，免疫功能恢复，PLT水平升高，提示Treg细胞、Breg细胞在ITP的发生、发展中均起到重要作用，是ITP治疗的两个潜在生物靶点，如能及时有效地提高Treg细胞、Breg细胞水平并改善其功能，纠正机体免疫功能紊乱状态，可作为ITP的一个新的治疗方法。