BMSCs对溃疡性结肠炎合并肝损伤小鼠的肝脏修复作用及对紧密连接蛋白表达的影响▲

彭家茵 邓哲君 孟云超 罗文捷 赵 磊 张启芳

(1 桂林医学院研究生学院，广西桂林市 541004； 2 广西医科大学研究生学院，广西南宁市 530021；广西壮族自治区南溪山医院3 消化内科，4 病理科，广西桂林市 541002)

肝脏紧密连接是由蛋白复合物组成的连续屏障结构，其将细胞膜分为基底侧和顶端侧，可限制胞膜内的蛋白运动，并能维持细胞极性。此外，紧密连接可调节细胞间通透性，限制水和溶质自由通过细胞旁间隙，同时阻止细菌产物、病原体及过敏原等进入组织[1]。肝脏中的紧密连接沿着胆管或肝细胞间分布，以封闭细胞旁间隙，使胆汁在胆管中流动[2]。溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)患者常合并肝损伤[3]。实验表明，葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate，DSS)不仅可诱导大鼠出现结肠炎，而且还可使得其肝组织中的紧密连接蛋白表达发生改变[4-5]。卞晶晶等[6]研究发现，经静脉移植的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)可迁移至急性肝损伤小鼠模型的肝组织内，减少肝组织炎症细胞浸润，改善肝脏组织结构排列。因此，本研究探讨BMSCs对UC合并肝损伤小鼠的肝脏修复作用及对肝脏紧密连接蛋白表达的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物 取15只无特定病原体级6～7周龄Balb/c雌性小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCK20070005)用于实验，体质量19～21 g，将其饲养于清洁级实验室，室内温度(20±4)℃，湿度45%～60%，通风良好，光照随昼夜浮动。另取4只无特定病原体级3周龄Balb/c雄性小鼠用于分离提取BMSCs，体质量9～11 g，来源及喂养要求同上。

1.2 主要实验试剂和仪器 4% DSS购自美国Sigma公司(批号：31404)，低糖DMEM购自美国Gibco公司(批号：31600034)，12%中性甲醛固定液购自北京雷根生物技术有限公司(批号：DF0113)，TRIzol试剂购自天根生化科技(北京)有限公司(批号：DP424)，反转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂购自立陶宛Fermentas公司(批号：K1622)。目的基因claudin-1、claudin-2、claudin-3、claudin-7、封闭蛋白(occludin)、闭锁小带蛋白1(zonula occludens 1,ZO-1)及内参基因α-actin的引物均由上海锐赛生物科技(集团)有限公司设计合成，引物序列见表1。Chemray240全自动生化分析仪购自美国Rayto公司，BX51光学显微镜购自日本Olympus公司，ML4002精密天平购自德国梅特勒-托利多公司，UV2401PC紫外分光光度计购自日本岛津公司，7500实时荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。

表1 引物序列

1.3 BMSCs的分离培养与鉴定 按照相关文献[7]中的方法进行BMSCs分离与培养，主要步骤为：颈离断处死3周龄Balb/c雄性小鼠，分离股骨，使用注射器抽吸低糖DMEM冲洗骨髓腔，冲洗液中的细胞经重悬后接种于无菌塑料培养瓶中，置于饱和湿度、37 ℃、5% CO2培养箱中培养，培养液为含10%胎牛血清的DMEM，培养24 h细胞贴壁后首次更换培养液，此后每2～3 d更换一次培养液。取形态均一、活性良好的第3～4代细胞进行鉴定，然后用于后续实验。根据国际细胞治疗协会2006年制订的多功能间充质干细胞的基本定义[8]对培养细胞进行鉴定：(1)贴壁生长；(2)细胞表面表达特异性抗原，通过流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD45、CD90的表达情况；(3)验证干细胞多向分化潜能，包括采用Von Kossa染色法评估抗坏血酸/甘油磷酸钠培养3周后BMSCs的成骨情况，以及油红O染色法评估经地塞米松诱导后BMSCs的成脂情况。

1.4 分组、建模和干预方法 将15只6～7周龄Balb/c雌性小鼠按随机数字表法分为阴性对照组、实验对照组及实验组，每组5只。阴性对照组小鼠正常饮水，其余两组小鼠每天自由饮用4% DSS水溶液，连续3周。造模期间，每天观察小鼠的精神状态、进食、饮水及活动等一般情况，每天定时称体重1次，记录小鼠粪便情况[7]。造模结束后第8天，给予阴性对照组和实验对照组小鼠经尾静脉注射PBS 0.3 mL，给予实验组小鼠经尾静脉注射0.3 mL的BMSCs悬液(含1×106细胞)进行干预1次。

1.5 标本的收集与处理 于BMSCs移植干预后第9天，摘除各组小鼠一侧眼球后取血0.7～1.0 mL，立即将血标本在4 ℃下以3 000 r/min离心5 min，取血清行肝功能指标检测。取血后采用颈椎脱臼法处死所有小鼠，打开腹腔，取出结肠组织和肝脏组织。将肝脏组织呈冠状位切开分为A、B两部分，将A部分置于12%中性甲醛中固定24 h后制作病理切片，将B部分放置于-80 ℃超低温冰箱中保存，用于实时荧光定量PCR检测。取结肠病变组织(阴性对照组则取相应部位的结肠组织)置于12%中性甲醛中固定24 h后制作病理切片。进行相应检测前须确认血清标本无溶血、冰冻肝组织无损毁、标签无脱落及标记清晰等情况。

1.6 测定肝功能 采用全自动生化分析仪检测小鼠血清ALT、AST、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和总胆红素水平。

1.7 制备组织切片及组织病理学观察 取固定后的结肠和肝脏组织，由广西壮族自治区南溪山医院病理专科技师进行脱水、透明、石蜡包埋，使用轮式切片机制作5 μm切片，贴片后烘片，进行HE染色。制作好的玻片由2名广西壮族自治区南溪山医院病理专科医师在显微镜下观察并拍照采图。

1.8 实时荧光定量PCR检测肝脏组织中紧密连接蛋白的mRNA表达水平 取约100 mg肝脏组织标本置于干净预冷的研钵中，倒入适量液氮，在全自动研磨仪中将肝脏组织标本研磨成粉末，按TRIzol试剂盒说明书提取总RNA，使用紫外分光光度计检测RNA纯度后，将其反转录成cDNA，使用实时荧光定量PCR仪进行PCR反应，每个标本重复上样3次。PCR总体系为20 μL，包括2×SYBR Green Mix 10 μL、引物Mix 1 μL、cDNA模板5 μL、超纯水4 μL。 PCR程序： 95.0 ℃预变性5 min；95.0 ℃ 变性10 s，60.0 ℃退火30 s， 72.0 ℃延伸30 s，40个循环。以α-actin为内参，采用2-ΔΔCt法进行半定量分析，计算目的基因的mRNA相对表达水平。

1.9 统计学分析 使用SPSS 25软件进行统计学分析。计量资料均以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BMSCs的鉴定情况 流式细胞检测结果提示CD29(+)、CD45(-)、CD90(+)，Von Kossa染色及油红O染色结果提示成功诱导BMSCs分化为成骨细胞、脂肪细胞，说明成功分离BMSCs。

2.2 3组小鼠造模期间一般情况及结肠组织病理变化 在造模期间，阴性对照组小鼠一般情况良好，大便成型；实验对照组小鼠皮毛缺乏光泽，体重下降，反应迟钝，活动减少，大便呈糊状或水状，逐渐出现血便或便血。实验组小鼠毛色光泽度差于阴性对照组小鼠，小鼠活动度基本正常，部分小鼠出现轻度体重减轻或便中带血，但症状轻于实验对照组小鼠。阴性对照组小鼠结肠上皮细胞、腺体排列规则，隐窝形态正常，未见炎症细胞浸润；实验对照组小鼠结肠黏膜上皮结构破坏明显，腺体及隐窝结构破坏，可见大量炎症细胞浸润黏膜固有层及黏膜下层；实验组小鼠结肠黏膜上皮结构尚规整，黏膜固有层腺体、隐窝基本正常，可见少量炎症细胞浸润黏膜固有层，程度明显轻于实验对照组。

2.3 3组小鼠血清肝功能指标的比较 实验对照组小鼠的血清ALT、AST、ALP及总胆红素水平均高于阴性对照组(均P<0.05)；实验组小鼠的血清ALT、AST、总胆红素水平均低于实验对照组(均P<0.05)，而实验组小鼠的血清ALP水平较实验对照组有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 3组小鼠血清肝功能指标的比较(x±s)

2.4 3组小鼠肝脏组织病理学的改变情况 阴性对照组小鼠肝脏结构大致正常。实验对照组肝小叶结构不完整，肝索结构不清，肝窦变窄，小叶间静脉及中央静脉呈瘀血样改变，可见炎症细胞浸润及少量肝细胞坏死。实验组小鼠肝小叶结构基本完整，肝索放射状排列欠规则，肝窦间隙较实验对照组小鼠增宽，小叶间静脉瘀血较实验对照组小鼠减轻，肝细胞未见坏死，仅见少量炎症细胞浸润。见图1。

2.5 3组小鼠肝脏组织中紧密连接蛋白mRNA表达水平的比较 实验对照组小鼠肝脏组织的claudin-1、claudin-2、claudin-3、claudin-7及ZO-1 mRNA表达水平均低于阴性对照组(均P<0.05)；实验组小鼠肝脏组织的claudin-1、claudin-3、claudin-7及ZO-1 mRNA表达水平均高于实验对照组，而claudin-2 mRNA表达水平低于实验对照组(均P<0.05)。3组小鼠肝脏组织的occludin mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 3组小鼠肝脏组织中紧密连接蛋白mRNA相对表达水平的比较(x±s)

3 讨 论

紧密连接封闭胆管并保证胆汁在胆管腔内，构成血液-胆汁屏障；当紧密连接结构被破坏，胆汁返流入肝血窦，机体出现胆汁淤积。紧密连接蛋白在多种肝脏疾病中的表达均发生改变[9-11]。claudin是紧密连接蛋白的关键成分，目前发现了其至少有27个成员，主要功能包括调节细胞外通透性、细胞极性、细胞分化和增殖、细胞迁移和凋亡，以及介导细胞信号传导等[12]。其中，claudin-1基因的功能障碍会导致胆汁渗漏、肝内胆汁淤积和肝细胞损伤，引起新生儿硬化性胆管炎伴鱼鳞病[13]。此外，claudin-1在丙型肝炎病毒入侵肝细胞的过程中发挥着重要作用[14]。敲除claudin-2基因后胆汁中的Na+浓度降低，胆汁酸和脂质成分浓缩，胆汁流速降低，从而促进胆固醇结石的形成[15]。敲除claudin-3基因可导致旁细胞屏障功能降低，增加Ca2+、PO43-经肝胆管上皮的旁细胞转运，促进胆固醇结石形成[16]。occludin不仅起封闭细胞旁间隙作用，在信号通路的传导中也起重要作用。occludin高表达可使得紧密连接蛋白数量及上皮细胞跨膜电阻增加[17]。Miura等[18]的研究表明，claudin-3和occludin等蛋白的低表达水平可使得胆小管的结构破坏甚至消失。Zeisel等[19]研究发现，occludin在丙型肝炎病毒入侵肝细胞的过程中起重要作用。ZO-1属于膜连接鸟苷酸激酶蛋白家族，参与调节细胞内物质的转运，维持上皮极性，在细胞的增殖分化中发挥作用[20]。ZO-1的N端有与occludin等蛋白结合的区域，而C端可结合肌动蛋白，在其他紧密连接蛋白与肌动蛋白间起桥梁作用[21]。

本研究利用DSS构建UC模型，实验对照组小鼠在建模过程中体重下降，反应迟钝，活动减少，大便呈糊状或水状，逐渐出现血便或便血，结肠组织病理检查提示结肠黏膜上皮结构破坏明显，腺体及隐窝结构破坏，可见大量炎症细胞浸润黏膜固有层及黏膜下层，这提示成功建立UC模型；实验对照组小鼠的ALT、AST、ALP及总胆红素水平均高于阴性对照组(均P<0.05)，肝脏组织发生肝小叶结构紊乱、炎症细胞浸润等改变，这提示成功建立UC合并肝损伤小鼠模型。实验对照组小鼠肝脏组织中的claudin-1、claudin-2、claudin-3、claudin-7及ZO-1的mRNA表达水平均低于阴性对照组(P<0.05)，这提示UC可合并肝脏紧密连接受损。而注射BMSCs后，实验组小鼠的UC症状及结肠病理表现均有所减轻，肝功能及肝脏病理损伤均改善，且肝脏组织中的claudin-1、claudin-3、claudin-7及ZO-1 mRNA表达水平均高于实验对照组小鼠(均P<0.05)，这表明BMSCs对UC合并肝损伤小鼠模型的结肠及肝脏均具有修复作用，并可提高肝脏紧密连接蛋白mRNA的表达水平。研究表明，BMSCs经尾静脉注射进入血液循环后，可在损伤局部微环境及外周血的趋化作用下迁移至损伤部位，抑制肿瘤坏死因子α和白细胞介素等炎症因子的表达，并分泌肝细胞生长因子[22]，而肿瘤坏死因子α可抑制claudin-1、occludin和ZO-1表达[23-24]，肝细胞生长因子可刺激claudin-7通过细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶信号通路抑制细胞迁移和侵袭[25]。可见BMSCs可能通过抑制肿瘤坏死因子α及分泌肝细胞生长因子等来增强claudin-1、claudin-3、claudin-7及ZO-1的表达，从而实现对肝脏的修复作用。此外，本实验中的BMSCs还可能通过修复肠黏膜损伤，减少肠源毒素损伤肝脏。既往研究表明，间充质干细胞对结肠炎有治疗作用[26-28]，结合本研究结果，BMSCs或可成为治疗UC合并肝损伤的一种新方法。本研究结果还显示，实验对照组小鼠肝脏组织中claudin-2、occludin的mRNA表达水平有所下降，但在注射BMSCs后claudin-2、occludin的表达水平未见明显改善，这可能与机体的修复功能有关，其机制仍需进一步研究。

综上所述，BMSCs对UC合并肝损伤小鼠模型的肝脏有一定的修复作用，并可提高肝脏紧密连接蛋白mRNA的表达水平，其可能通过影响紧密连接蛋白的表达实现对肝脏的修复作用。