同源域蛋白同源盒基因通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞的增殖

凌丽 张菁 张宗敏 令狐熙涛 王钰莹

遵义医科大学附属医院1老年医学科，2骨科，3细胞工程室（贵州 遵义 563003）

胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率分别位于恶性肿瘤的第5位和第3位，胃癌的不同发展阶段是受多个基因调节的复杂过程，其关键的基因调控过程包括抑癌基因失活、原癌基因激活及细胞周期相关基因的异常表达[1-4]。

同源域蛋白同源盒基因（homeodomain-only protein homeobox，HOPX）位于4号染色体（4q11-4q12）上，在人类正常组织中广泛表达[5-6]。HOPX最初被认为是一种调节心脏生长发育、诱导心力衰竭的基因，HOPX的表达下调将会引起心肌肥大和心力衰竭[7-8]。近年研究表明HOPX作为一种抑癌基因在多种肿瘤中低表达，能调控肿瘤的发生发展。但HOPX在胃癌中的生物学作用及分子机制尚不清楚，本研究旨在探讨HOPX在胃癌中的调控作用及机制[9-10]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床组织及细胞系临床组织样本来源于中山大学附属第六医院接受手术的胃癌患者的癌组织及癌旁组织，手术切除后的组织标本用液氮速冻后保存于-80℃冰箱，所有患者均签署知情同意书。人胃癌细胞系（BGC823、HGC27、SGC7901、AGS、NKM45、NKM28、MGC803）和永生化人胃上皮细胞GES1，由广州医科大学实验室惠赠，于本实验室保存。

1.1.2 主要试剂胎牛血清、胰蛋白酶、Opti-MEM、DMEM（GIBCO）；Lipofectamine 3000（Invitrogen）；HOPX质粒（Longbio）；HOPX抗体（santa）；p-GSK-3β（Ser9）、GSK-3β、β-catenin、α-Tubulin及P84抗体（Abcam）；CCK-8试剂盒（DOJINDO）；结晶紫染料、细胞周期试剂盒、EdU试剂盒（碧云天）；双荧光素酶报告基因试剂盒、RT-qPCR试剂盒（Promega）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养所有细胞均培养于含10%FBS的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 RNA提取及qRT-PCR按照Trizol说明书提取细胞及组织总RNA，用HiSciptⅢcDNA Sythesis Kit试剂盒进行逆转录合成cDNA，SYBR Green染料法进行RT-qPCR反应，以GAPDH作为内参，使用公式2-△△CT计算基因相对表达量。

1.2.3 Western blot检测蛋白表达参考组织、细胞蛋白试剂盒说明书提取细胞和组织蛋白，BCA法定量蛋白含量。取30 μg蛋白行SDS-PAGE电泳，300 mA恒流转膜2 h后5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4℃孵育过夜；1×TBST洗膜10 min×3次，加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，1×TBST洗膜10 min×3次。加入ECL工作液对条带进行显影。以α-Tubulin或P84为内参，测定HOPX、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin及Cyclin D1的蛋白水平。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequence for real-time fluorescence quantitative PCR

1.2.4 构建稳定细胞株消化收集293T细胞，以2×106个/皿接种于10 cm培养皿中，待细胞贴壁后进行病毒包装。取6 μg HOPX质粒、3 μg psPAX2和2 μg PMD2.G质粒共转染293T细胞，48 h后收集上清病毒液，0.45 μm滤器过滤后感染胃癌细胞，48 h后加入浓度1 μg/mL的嘌呤霉素，完成稳定细胞株筛选后，收集细胞总蛋白及RNA，qRT-PCR和Western blot检测HOPX基因的过表达情况。

1.2.5 CCK-8测定细胞活性将HGC27/HOPX、BGC823/HOPX细胞及对照组细胞以1 000个/孔铺于96孔板中，每孔体积100 μL，待细胞培养24 h后吸去培养基，随后每孔加入100 μL含10%CCK-8的培养基孵育2 h，酶标仪检测450 nm处吸光度值。每隔24 h检测一次，连续检测6 d。

1.2.6 平板克隆形成实验分别将过表达HOPX的胃癌细胞及对照组细胞（500个）接种于6孔板中，隔两天补100 μL新鲜培养基，当克隆形状明显时（＞50个细胞/克隆）弃去培养基，PBS洗2次后甲醇固定15 min，再用1%结晶紫染色2 min，PBS洗涤后拍照统计克隆数。

1.2.7 流式细胞术检测细胞周期消化收集细胞，调整细胞密度至5×105个/孔接种于6孔板中，待贴壁后换为无血清培养基培养24 h，完全培养基继续培养12 h后收集细胞，70%乙醇固定，加入含有RNase的PI避光染色15 min，流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.8 EdU实验将5×104个细胞铺于24孔板的圆玻片上，培养24 h后，参考BeyoClickTM EdU-488说明书，每孔加入500 μL浓度为20 μmol/L EdU的培养基孵育2 h，4%多聚甲醛固定细胞，0.3%Triton X-100的PBS通透后加入Azide 488反应；DAPI染核10 min，PBS清洗3次，将圆玻片反扣于滴加有防淬灭剂的载玻片上，荧光显微镜拍照，并对EdU阳性细胞率进行统计。

1.2.9 双荧光素酶报告实验加入裂解液充分裂解细胞，取20 μL裂解液加至96孔培养板中，并设置3个复孔。将（50×）萤火虫萤光素酶底物用对应的缓冲液稀释至1×工作液室温孵育30 min，随后加入萤光素酶工作液（100 μL/孔），轻晃混匀后在酶标仪中测量萤光素酶数值，再加入海肾萤光素酶工作液（100 μL/孔），轻晃混匀后在酶标仪中测量海肾萤光素酶的数值，最后分析数据。

1.3 统计学方法所有数据均使用SPSS 16.0软件进行处理及分析，P＜0.05为差异有统计学意义。每个都数据采用均值±标准差的形式表示，组间比较采用双侧Student't检验，所有数据均包含3次独立实验。

2 结果

2.1 HOPX在胃癌组织及细胞中低表达采用Real Time-PCR及Western blot检测HOPX在胃癌组织及细胞系中的表达水平，结果见图1A，与人永生化胃上皮细胞GES1相比，7株胃癌细胞系中的HOPX mRNA和蛋白质表达水平均显著降低（P＜0.01）。进一步检测HOPX在6对组织中的表达，结果表明胃癌组织中HOPX的表达显著低于癌旁组织（图1B，P＜0.01）。

2.2 HOPX抑制胃癌细胞的增殖构建了稳定过表达HOPX基因的HGC27和BGC823细胞株，并检测其mRNA及蛋白表达水平以验证稳定细胞株是否构建成功，结果如图2A所示，与对照组相比，HGC27/HOPX及BGC823/HOPX的mRNA和蛋白表达水平显著上调（P＜0.01）。培养HGC27/HOPX及BGC823/HOPX细胞时，观察到与对照组细胞相比，HGC27/HOPX及BGC823/HOPX细胞的增殖速度明显减弱，CCK-8实验结果表明过表达HOPX的胃癌细胞的增殖速度明显慢于对照组细胞，差异具有统计学意义（P＜0.01，图2B）。同时过表达HOPX显著抑制胃癌细胞的克隆形成能力（图2C）。

2.3 HOPX抑制胃癌细胞的细胞周期利用EdU掺入实验及流式细胞术检测细胞周期的变化。结果见图3A，HGC27/HOPX细胞中EdU阳性率为对照组的45.12%，BGC823/HOPX的细胞中EdU阳性率仅为对照组的37.65%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。细胞周期实验结果表明，HGC27/HOPX的细胞处于S期的比例为21.08%，而HGC27/pSin的细胞处于S期的比例为40.80%；BGC823/HOPX的细胞处于S期的比例为20.23%，而BGC823/pSin的细胞处于S期的比例为42.72%，差异具有统计学意义（P＜0.05），且各组间的G2/M期差异无统计学意义，G0/G1期与S期的分布率呈反比（图3B）。以上结果表明过表达HOPX可使胃癌细胞阻滞在G0/G1期，抑制细胞进入S期。

2.4 HOPX抑制Wnt信号通路Wnt信号通路参与肿瘤细胞的癌变并对维持肿瘤细胞的增殖至关重要，GSK3β是Wnt/β-catenin信号通路中的核心成分，GSK3β的Ser9位点被磷酸化是其活性下降的重要途径。结果显示，过表达HOPX后，GSK3β（Ser9）的磷酸化水平、β-catenin的表达水平及细胞周期促进因子cyclin D1的表达水平均显著降低（图4A）；双荧光素酶报告基因实验发现过表达HOPX可显著降低β-catenin/TCF/LEF的转录活性（图4B；Western blot实验结果发现胃癌细胞核内β-catenin的表达量显著减少，β-catenin蛋白由细胞质进入细胞核即发生核转位的量减少（图4C）。综上所述，本研究结果表明过表达HOPX可能通过抑制GSK3β（Ser9）的磷酸化水平从而促进β-catenin磷酸化进而被蛋白酶体降解，并通过减少其下游靶基因细胞周期促进因子cyclin D1的表达，最终达到抑制胃癌细胞的增殖能力。

3 讨论

胃癌是一种起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，近年来我国胃癌患者的发病年龄趋于年轻化，19～35岁的年轻胃癌患者明显增多，总体发病率和病死率约超过全球平均水平的2倍[11-13]。虽然胃癌的治疗效果随早期诊断和综合治疗方案的改善得到一定程度提高，早期患者存活率经治疗后可提高至90%以上，但晚期胃癌患者的治疗后存活率仍不超过30%[14-15]。大部分研究表明胃癌的进展可能与基因突变、环境及生活饮食习惯改变等有关，然而，胃癌的主要发病机制目前尚未完全阐明[16-18]。因此，寻找胃癌的早期诊断标志物以达到尽早防治胃癌的发生发展，对于提高胃癌患者的预后至关重要。

HOPX基因在人类正常组织中广泛表达，主要是由HOPX启动子高甲基化诱导形成，最初的研究发现HOPX基因是心脏生长发育的关键调节基因[7]，随着研究深入，目前的研究表明HOPX在鼻咽癌、结肠癌及肺癌等肿瘤中呈低表达状态[19-21]。钟玉斌等[22]发现非小细胞肺癌中HOPX的表达水平较正常支气管组织显著降低，且HOPX与患者临床分期及TNM分期显著相关，推测HOPX起着抑制非小细胞肺癌发生发展的作用，有望成为非小细胞肺癌早期诊断及判定预后的一个新指标。另外，任先越等[22]发现，HOPX启动子区在鼻咽癌细胞中呈高甲基化导致HOPX表达下调，过表达HOPX后可抑制鼻咽癌细胞的增殖及转移能力并增强化疗敏感性。由此推测HOPX在多种肿瘤中发挥着抑制肿瘤进发展的作用。本研究通过Real time-PCR及Western blot实验发现与永生化人胃上皮细胞GES1相比，HOPX在胃癌细胞中的mRNA及蛋白表达水平显著减少，且HOPX在胃癌组织中的mRNA及蛋白表达水平较癌旁组织显著减少。进一步在体外构建了过表达HOPX的稳定胃癌细胞HGC27和BGC823株，随后通过一系列生物学功能实验检测过表达HOPX对胃癌细胞的增殖能力的影响，结果显示过表达HOPX可显著抑制胃癌细胞的增殖能力，并可抑制胃癌细胞的周期运行。

Wnt/β-catenin是肿瘤发生发展过程中的一个关键信号通路，主要包括 Wnt、GSK-3β、β-catenin和TCF/LEF等细胞外转录因子[24-25]。在正常细胞中Wnt/β-catenin通路通过GSK-3β磷酸化修饰后被降解，而在肿瘤细胞中，由于部分通路分子的缺失如GSK-3β的Ser9位点被磷酸化后活性下降，最终使β-catenin免于被降解[26]。本研究结果显示，过表达HOPX后GSK3β（Ser9）的磷酸化水平及β-catenin的表达均显著降低，胃癌细胞细胞核内β-catenin的含量减少。表明HOPX可通过抑制GSK3β（Ser9）的磷酸化水平使β-catenin被泛素化酶降解，同时抑制β-catenin从细胞质转位到细胞核而无法激活下游基因CyclinD1的转录，最终抑制胃癌细胞的增殖。

综上所述，HOPX在胃癌细胞的发生发展过程中发挥着重要调控作用，其机制是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路从而抑制胃癌细胞的增殖，因此，HOPX是一个评估胃癌进展的潜在生物标志物。