延安地区马铃薯镰刀菌根腐病病原菌鉴定试验

王春霞 王 飞 刘 欢

（延安市农业科学研究所 陕西延安 716000）

马铃薯作为世界第4大粮食作物，其地位仅次于玉米、小麦和水稻[1]。从2016年开始，农业农村部就将马铃薯主粮化作为推动马铃薯产业发展的关键策略提上日程，以期解决新形势下我国粮食安全战略的部署。马铃薯因其具有适应性强、耐旱、抗寒、产量高等特点，在延安地区的种植历史比较悠久。马铃薯是延安市仅次于玉米的第2大粮食作物，连年种植面积达5万hm2，是陕西省种植马铃薯的第2大市[2]，且马铃薯产业在陕西省农业发展中也占有重要地位[3]。近些年，随着马铃薯产业的不断发展，种植面积也越来越大，马铃薯各种病虫害的发生也逐年增多、加重，真菌性病害马铃薯镰刀菌根腐病普遍发生在马铃薯的生长期和储藏期，其为害部位主要为马铃薯苗期的根茎部、根部及储藏期的薯块，不仅在一定程度上制约着马铃薯的产量，影响经济效益，也对马铃薯储藏期的品质存在一定的影响，已经成为限制延安地区马铃薯产业高质量、可持续发展的重要因素之一[4]。因此，本研究通过病原菌分离培养、致病性鉴定、形态学和分子生物学鉴定，明确了延安市马铃薯镰刀菌根腐病病原菌的种类，以期为该病害的发生、防治提供一定的理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2021年在延安市地区采集具有典型镰刀菌根腐病症状的马铃薯根茎，标记好采集地点、采集时间、采集人员等基础信息，带回实验室用于病原菌的分离。试验所需试剂包括Biospin真菌基因组DNA提取 试 剂 盒、ddH2O、2×EasyTaq PCR SuperMix、Trans 2K DNA Marker、Gelstain和50×TAE电泳缓冲液等；主要仪器包括恒温光照培养箱、超净工作台、PCR仪、电泳仪、低温冷冻离心机等；用于分离病原菌的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌形态学鉴定 采用组织分离法对采集到的马铃薯患病样本进行分离[5]，将分离到的镰刀菌用单孢分离法对其进行纯化，然后将纯化后的菌株转接在PDA培养基上，根据显微镜下病原菌孢子的形态特征，参考《镰刀菌属》[6]一书进行病原菌形态学的初步鉴定。

1.2.2 致病性测定 根据柯赫氏法则[4]，采用马铃薯根部切伤接种法检测分离到的病原菌的致病性[7]。先将在花盆中长至高约20cm的马铃薯的根基部用消过毒的小刀划出伤口，然后将配制好的茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌的菌悬液浇注到马铃薯的伤病处，以浇注清水作为对照，后期进行正常的浇水、施肥管理，待根基部或根部出现明显病斑时再分离病原菌，确定其致病性。

1.2.3 病原菌分子生物学鉴定 分离到的病原菌DNA用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取，后利用镰刀菌属特异性引物EF-1α序列[4]进行PCR扩增，扩增后将扩增产物送到上海生工生物工程有限公司进行测序，测定的序列在NCBI网站进行BLAST比对，根据比对结果从GenBank数据库获得最近似的镰刀菌序列，以及其他种类的镰刀菌序列，利用MEGA 5.20分析软件采用NJ法构建马铃薯镰刀菌根腐病病原菌的系统发育树，分析比较分离到的菌株与其他菌株间的亲缘关系，确定菌种类别。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离

2021年起在延安市8个市县区进行马铃薯镰刀菌根腐病的调查及对病样的采集，在延安市采集的薯块上分离到3株病原菌，标记为S1-1、S1-2和S1-5；在子长市的马铃薯茎基部分离到5株病原菌，标记为S2-1、S2-2、S2-3、S2-4和S2-6；在志丹县的马铃薯根部上分离到2株病原菌S3-1和S3-2，在薯块上分离得到S3-4和S3-5菌株；在吴起县的薯块上分离到S4-1和S4-3菌株；在安塞区的薯块上分离到S5-1、S5-2和S5-3菌株；在延长县马铃薯茎基部分离到S6-1菌株；在延川县的马铃薯茎基部分离到S7-2菌株；在富县的薯块上分离到S8-1菌株（附表）。从20株菌株的分离部位上来看，大多数病原菌是从马铃薯患病薯块和茎基部病斑上分离的，只有2株菌株是从根部的病斑上分离的。

附表 病原菌菌株编号及分离部位

2.2 病原菌株的形态特征

通过观察PDA培养基上各个菌落的形态特征，初步将分离到的菌株分为2类，进一步通过显微观察其小型分生孢子、大型分生孢子及产孢梗等的形态特征，以编号为S5-2的一类菌株，小型分生孢子较多，形状多为卵形或椭圆形，具分隔，但大多数无隔；大型分生孢子整体偏平直，中间稍弯曲，顶胞比较尖，基胞足跟相对明显，具分隔，多为5隔。经形态学鉴定，初步将具有此类特征的菌株鉴定为尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）（图1左为尖孢镰刀菌的大型分生孢子）。其次，以编号为S7-2的一类菌株，小型分生孢子普遍多，易产孢，以椭圆形和肾形为主，具有分隔；大型分生孢子普遍较少，形状多为马特形，两端较圆，略微弯曲，具分隔，多为3隔。经形态学鉴定，初步将具有此类特征的镰刀菌鉴定为茄病镰刀菌（Fusariumsolani）（图1右为茄病镰刀菌的大型分生孢子和产孢梗）。

2.3 致病性鉴定

通过致病性测定结果，从接种后发病的马铃薯苗茎基部的病健交界处重新分离得到的镰刀菌菌株，其菌株形态与接种镰刀菌的形态相符，因此得以证明实验初从所采集的病样上分离到尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌菌株都具有致病性。

2.4 分子鉴定

通过EF-1α引物对分离到的20株镰刀菌进行序列测定，获得长度721～752 bp之间的序列，后用NJ法构建马铃薯镰刀菌根腐病病原菌的系统发育树。通过图2可以看出，编号为S5-2、S4-3、S3-4、S8-1等6个菌株与尖孢镰刀菌 （Fusariumoxysporum）KJ647280.1和JQ965436.1的同源性达到97%，又与编号为S1-1、S3-1、S2-4、S1-5等8个菌株同源性达到96%，说明这一类的14株镰刀菌均为尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）。编号为S7-2的菌株与茄病镰刀菌（Fusariumsolani）KP143718.1的同源性为98%，与编号为S6-1、S3-2、S5-1等5个菌株的同源性为97%，说明这一类的6株镰刀菌为茄病镰刀菌（Fusariumsolani）。因此认为，分离到的20株镰刀菌，14株鉴定为尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum），6株鉴定为茄病镰刀菌（Fusariumsolani）。分子生物学鉴定的结果同形态学鉴定的结果一致，说明在镰刀菌的鉴定上形态学结合分子生物学能够很好的将镰刀菌鉴定到种的水平上。

3 讨论与结论

马铃薯作为我国的第4大粮食作物，具有粮蔬饲兼用的特点，在农业发展中有着很高的经济效益[8]。延安市作为陕西省马铃薯种植的主产区之一，马铃薯产业正朝着高质量的方向飞速发展，但随着种植面积的增加，不轮作、不倒茬成为马铃薯种植者种植马铃薯的常态化运作，导致土传病害在马铃薯上发生越来越重，防治越来越难。

根据相关调查，马铃薯镰刀菌根腐类病在陕西省也呈现逐年加重的态势，如何高效防治镰刀菌根腐类病害的发生，首先是要明确引起该类病害的致病病原菌种类，因此病原菌的分离鉴定成为马铃薯产业上亟需解决的关键技术问题，有关引起马铃薯镰刀菌根腐类病的研究报道较多，杨波等[9]对引起青海地区马铃薯镰刀菌根腐病的病原菌进行了分离鉴定研究，认为三线镰刀菌（Fusariumtricinctum）、尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）等6种镰刀菌是主要的致病病原菌；王喜刚等[7]的研究认为，引起宁夏地区马铃薯根腐病的主要病原镰刀菌为接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum）和茄病镰刀菌（Fusariumsolani）；李金花等[10]的研究表明，接骨木镰刀菌（Fusariumsambucinum）和茄病镰刀菌（Fusariumsolani）同样是引起甘肃省马铃薯根腐病的优势病原菌。不同地区由于地理环境等的差异导致引起该病害的病原菌也不同，本试验通过对延安马铃薯产区镰刀菌根腐病病原菌的形态学鉴定、分子学鉴定及致病性测定，初步认定了尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）和茄病镰刀菌（Fusariumsolani）是引起该病害的主要致病病原菌。延安市马铃薯产区尚未报道有由真菌镰刀菌引起的马铃薯根腐病的病原鉴定，通过本试验首次确定了引起延安马铃薯产区镰刀菌根腐病的致病病原菌的种类，为后期防治马铃薯镰刀菌根腐病提供科学依据，能够做到有针对性的防、有的放矢的治。