eccDNA在癌症中的研究进展

于承平 崔永康 综述 李林强 审校

染色体外环状DNA(extrachromosomal circular DNA，eccDNA)是近年来发现的，并存在于染色体外的环状DNA分子。Stahl首次提出，DNA可能在高等生物的染色体外以一系列环状形式存在。1965年，Zuo等[1]对公猪精子DNA分离提取并发现eccDNA，并进一步验证该理论。目前研究发现eccDNA具有独立存在于染色体之外的、呈独立的环状DNA结构、重复的基因组序列、与染色质基因序列相同、数百碱基至数千碱基组成等一系列特征。越来越多的证据已经证明了eccDNA在肿瘤的异质性、侵袭性、进化和化学抗性方面发挥功能，大体总结为通过驱动肿瘤异质性使癌细胞可以快速适应治疗方案和环境变化。因此，有人提出eccDNA将会是癌症治疗的新靶点，还可作为新型生物学标志物用于癌症诊断和治疗预后评估。本文就eccDNA的分类、形成机制、在癌症中的表达及作用进行综述。

1 eccDNA的分类

1.1 小多分散DNA(spcDNA)

spcDNA最初是在19世纪70年代由Radloff在一篇介绍染料浮力密度离心纯化环形DNA的文章中提出的[2]。研究发现，spcDNA的长度为数百碱基至数千碱基不等[3]，来源于基因组的重复序列[2，4-5]。Krolewskla等[4]对非洲绿猴肾细胞分离纯化得到spcDNA，大小约为300 bp。Hollis等[2]在外周血淋巴细胞的spcDNA中分离得到人类基因组中短且重复的序列-Sau3A家族。研究表明，范可尼贫血(Fanconi Anemia，FA)、着色性干皮病(Xeroderma Pigmentosum，XP)、结肠癌细胞和宫颈癌上皮细胞(HeLa)等组织和细胞中富含spcDNA[5]。在致癌物诱导正常细胞癌变的过程中，细胞产生大量spcDNA[3]：药物环乙酰亚胺或抑制DNA复制的药物如羟基脲(HU)或1，7-二甲基苯并蒽(DMBA)加萘二酸处理小鼠的细胞后，细胞中spcDNA水平升高；同样在对细胞进行烷化剂甲基硝基亚硝基胍(MNNG)和其他致癌物处理后，啮齿动物细胞中的spcDNA数量增加。由此可见，spcDNA的产生与基因组不稳定密切相关。在spcDNA形成过程中，在致癌原影响下染色体重组会提高基因组的不稳定性；spcDNA形成后，致癌原诱导的spcDNA可能作为突变体，进一步促使染色体异常[3]。

1.2 端粒环

端粒是位于每个染色体臂末端的核蛋白结构，由一个高度保守的六聚体(TTAGGG)串联重复DNA序列形成[6]，大小约为738bp的整数倍[7]。其作用在于保护DNA不被降解和融合。端粒环最初在哺乳动物中被发现，随后相继在原核生物、植物、线虫和鸟类的端粒中被发现[8]。端粒环是端粒DNA的3′末端外伸突出形成单链富G重复序列的套索样结构，本质是保护端粒的3′末端[6，9]。端粒环的形成是端粒重复序列间的基因重组或从端粒中切除的结果[10]。研究发现，端粒重复序列结合因子2(Telomere repeat binding factor 2，TERF2)促进端粒3′端DNA的末端卷曲，并在端粒环形成和维持过程中至关重要[9]。当端粒环形成后，其通过滚动循环扩增不断增大，产生端粒重复序列，使端粒延长[10]。由此可见，端粒环在维持端粒长度中起重要作用。也有文献报道，端粒环形成调控相关蛋白，如起源识别复合物(Origin recognition complex，ORC)和Werner综合征蛋白(Werner syndrome protein，WRN)[11]，在端粒环的形成中发挥重要作用。已有研究发现端粒替代延长机制(Alternative lengthening of telomeres，ALT)在肉瘤、胃癌、中枢神经系统恶性肿瘤、肾癌(Wilm′s肿瘤)、膀胱癌、间皮瘤、恶性黑色素瘤和生殖细胞睾丸癌等中发挥重要作用[7]。目前尚没有文献具体阐述端粒环在ALT中的作用。

1.3 染色体外rDNA环(Extra-chromosomal Ribosomal Circles，ERCs)

ERCs首次在衰老酵母的核仁中被发现[11]。rDNA基因序列位于染色体1、12、13、14、15、21、22上，由150～200个串联重复序列组成[11-13]。DNA重复序列的存在，使核糖体DNA基因组具有不稳定性[12]。在DNA复制过程中，DNA双链断裂可以通过同源重组来修复，同源重组修复缺失，导致ERCs的形成[13]。也有证据表明，酵母中核糖体DNA复制岔口停滞，从而形成ERCs[14]。在衰老的细胞中，ERCs的含量大量增加。研究发现酵母细胞进入衰老之前，ERCs的表达水平呈指数形式增加[11]。由此可见，ERCs的积累与酵母细胞衰老呈正相关。

1.4 微DNA(microDNA，miDNA)

miDNA最早在小鼠的大脑细胞中发现，曾被认为是eccDNA的唯一存在形式[15]。miDNA长度仅在200～400 bp之间[16]，主要来源于非重复基因组序列[17]。研究发现，小鼠组织及人类细胞系的基因组5′端、外显子和CpG基因组中高度富集miDNA。miDNA中含有丰富的GC碱基对[18]。另外，在miDNA起始段和末端存在长度为2 bp～15 bp的重复基因序列[15，17-18]。有文献报道，miDNA的产生在一定程度上也与转录和RNA代谢有关[17]。Paulsen等[16]应用LAMA(Ligase-assisted mini-circle accumulation)技术对人肿瘤细胞的miDNA进行测序，并人工合成相应的miDNA，进行体内外转染，发现其可以转录为相应的miRNA，这一过程不依赖于经典的启动子机制。不仅如此，miRNA可以发挥相应的作用，通过调控下游靶基因的变化，进而影响肿瘤的进展[19]。

2 eccDNA的形成机制

2.1 损伤修复机制的缺失

正常细胞通过激活强劲的DNA损伤修复机制(DDR)途径对DNA损伤做出反应，每一种修复都通过不同的机制。在细胞周期的不同阶段，至少有七种主要的DNA修复途径——碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)、错配修复(MMR)、同源重组(HR)和非同源端连接(NHEJ)、直接化学逆转切除以及链间交联(ICLs)修复，使细胞能够修复DNA损伤[20]。BER和NER具有相对保真性，但大量碱基或核苷酸切除时，可能意外激活某种DNA聚合酶，引起碱基、核苷酸聚集，从而产生长度不一的eccDNA。NHEJ通路以一种灵活的方式利用蛋白质识别、切割、聚合和连接DNA末端。但NHEJ的缺失极易引起DNA双链断裂(DSBs)。DSBs是最危险的DNA损伤类型，因为DSBs可以导致大的染色体结构的游离丢失[21]，且存在产生eccDNA的可能。

2.2 DNA复制过程中出错

DNA复制过程中错误地激活DNA聚合酶且在模板链上产生一个环形DNA分子，这个环被切除并形成一个圆形结构，并在染色体上留下一个微小缺口[22]。DNA复制具有相对保真性，当然这种出错的概率较小，但不排除产生eccDNA的可能。

3 eccDNA的研究新进展

越来越多的研究表明，eccDNA在癌症中异常表达且发挥重要作用。Kumar等[15]对23例恶性肿瘤患者(12例肺癌和11例卵巢癌)的血清及血浆样本分析发现，12例肺癌患者中有8例，11例卵巢癌患者中有7例，即近三分之二的患者在肿瘤切除后血浆中miDNA长度减少，原因可能是原位生长的肿瘤释放出更长的miDNA进入血液循环中。由于涉及伦理学，尚不能确定其余三分之一患者术后miDNA较术前长是否与肿瘤复发有关[15]。Mehanna等[23]用甲氨蝶呤(MTX)和L-天冬酰胺酶(ASP)处理人淋巴母细胞样细胞系(LCLs)诱导其细胞凋亡和DNA断裂，然后提取miDNA并测序发现，两种药物治疗的LCLs产生的miDNA数量显著多于对照组，且在MTX组中这一现象更为明显，表明化疗可能影响miDNA的产生及表达。

文献报道，使用中性二维(2D)凝胶电泳，通过与总基因组DNA或特定探针杂交后，可以区分典型的超卷曲分子、圆形及线性分子[3]。这使得在相对较小的总DNA样本中识别环形分子，并便于eccDNA的结构及功能研究。果蝇胚胎含有丰富的松弛的环形分子组成的eccDNA，约占总DNA含量的1%～2%。在通过研究果蝇衰老与eccDNA的关系时发现，果蝇的衰老并不伴随eccDNA的积累；相反，它的水平可能会逐渐降低[24]。Tunner等[25]通过全基因组测序，结合癌症基因组图谱(TCGA)，分析13种不同的癌症发现，所有扩增癌基因均可以以eccDNA的形式存在。eccDNA的表达水平在不同类型的肿瘤中有所不同。在恶性胶质瘤中，eccDNA阳性率较高；而在结肠癌和血液病中eccDNA阳性率较低[25]。

eccDNA除了在肿瘤组织中表达丰富外，在自然界生物体也存在环状DNA，如乙型肝炎病毒(HBV)通过诱导DNA的前基因组RNA(pgRNA)逆转录复制，产生异常结构的松弛环状DNA(RC-DNA)。RC-DNA通过复杂的转化形成闭合环状DNA(cccDNA)，进而在体内尤以在肝脏器官中表达显著[26]。cccDNA 作为新兴研究的治愈性靶点，在未来慢性乙型肝炎可能被治愈[27]。

此外，eccDNA与癌症的耐药密切相关。顺铂(DDP)耐药是降低化疗效果的重要因素，从而导致下咽鳞状细胞癌(HSCC)局部复发和淋巴结转移。Wu等[28]证实eccDNA上编码的癌基因在肿瘤转录组中高度表达。Lin等[29]对HSCC细胞系FaDu和DDP抗性细胞系FaDu/DDP中eccDNA提取分析发现，DDP抗性细胞系FaDu/DDP存在大量的eccDNA；eccDNA上RAB3B基因过表达提高FaDu细胞对DDP的抗性，诱导FaDu细胞的自噬，进而促使HSCC耐药。文献报道，胶质母细胞瘤组织标本的eccDNA中检测出大量表皮生长因子受体(EGFR)[30-31]，其易突变为活跃的变异体EGFRVⅢ[31]，而EGFRVⅢ对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)不敏感，从而使肿瘤细胞对TKIs耐受，导致治疗效果不佳。另外，eccDNA与宫颈癌的耐药可能相关[32]。

4 小结与展望

目前，eccDNA的神秘面纱已逐渐被揭开，其在癌症中的表达及重要作用等已逐渐显现，但这只是冰山一角。以往对于癌症的研究报道，多是基于染色体的基因进行研究，而忽视了染色体外的基因，如eccDNA。另外，eccDNA也可以重新嵌合至染色体形成线性DNA，方式发生改变且进一步发挥作用，这可能是临床癌症治疗效果差强人意的重要原因之一。相信随着研究的逐渐深入、数量的增多及相关技术的不断成熟，eccDNA在癌症发生发展中的机制会逐渐明晰，可为癌症的早期诊断、治疗提供更多的靶点和思路。