广谱性抗体的制备及其在食品安全快速检测中的应用进展

张开惠,刘源,崔艳,吴昊芬,徐永俊,马子煜,季艳伟

(西北农林科技大学 食品科学与工程学院,陕西 杨凌,712100)

食品安全仍是当今世界范围内的首要问题之一,世界卫生组织指出,多种疾病和失调均与食品安全有关,食品安全已被世界卫生组织列为高度优先事项[1],因此,建立保障食品安全的检测体系显得尤为重要。目前,常用的仪器分析方法如高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法等,虽然具有特异性强、准确度高等特点,但往往需要繁琐的前处理步骤和检测过程、昂贵的仪器设备、专业化的技术人员及较长的检测周期,不适用于快速筛查和现场检测[2-3]。基于抗原抗体特异性反应的免疫学检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、成本低、易于商业化生产且可实现现场即时检测等优点,在食品安全快速检测中已得到了广泛应用[4-5]。

目前,常用的免疫学检测方法如酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫层析检测法,多采用针对一种靶分子的单克隆抗体进行特异性检测(图1-A),但由于食品成分复杂,食品中往往含有多种结构类似的危害物,如生物毒素、农兽药残留及非法添加物等。当多种同类危害物共存时,由于危害物间毒性机理相似,即使单个危害物不超标,食品仍存在很大的毒性积累风险[6],而针对多种危害物的同时检测方法既能提供更加丰富的样品信息从而降低假阴性结果,又能减少检测时间和成本,因此已经被广泛应用于食品安全快速检测领域[7]。目前,针对多种危害物的同时检测方法多采用不同信号标记材料对多个不同抗体分别进行标记,或者仅用一种标记材料,通过将多个不同抗体分别固定在不同区域,一次加样检测,获得多种被分析物的信号(图1-B)。然而,“并联式”检测区域设计及制备的复杂性随着检测区域数量的增加而增加,并且样品溶液在通过多个检测区域时流量变化的不确定性将影响其检测的准确性[8]。还有文献报道采用多克隆抗体实现多种危害物的同时检测,虽然多克隆抗体易制备、生产成本低,但其组分不单一、特异性较低、批次间差异较大的特点导致基于多克隆抗体的检测方法不稳定,较难满足市场需求。相比于多克隆抗体,广谱性抗体基于一类或几类物质的共有结构而实现对这一类或几类物质的广谱性识别[9]。相较于“并联式”检测方法,基于广谱性抗体的多危害物检测方法凭借“以一代多”的特点使其具有更低的成本和更高的检测效力,在大批量样品的初步、快速筛查中具有重要意义(图1-C)。

本文主要综述广谱性抗体的制备方法,提高广谱性抗体的广谱性及亲和力的常用策略,以及其在毒素类、农兽药类残留和其他常见食品危害物检测中的应用现状。

A-单一危害物的免疫层析检测法;B-针对多种危害物的多重免疫层析法;C-基于可识别4种危害物的广谱性抗体的免疫层析检测法图1 基于免疫层析检测法检测样品中的4种危害物Fig.1 Detection of four kinds of hazards in samples based on immunochromatography

1 广谱性抗体的制备方法

广谱性抗体是广谱性免疫学检测方法的核心识别元件,抗原的设计及合成是制备广谱性抗体的关键步骤。抗原设计和合成的方法主要有以下3种:混合抗原法、多重抗原法及基于共同抗原表位的通用型结构抗原法,除此之外,还可以通过基因突变等基因工程手段进一步提高抗体的广谱性和亲和力。

1.1 混合抗原法

混合抗原指多种抗原的混合物组成的免疫原,来自不同免疫原的多种抗原表位有利于刺激更多样的B细胞的增殖从而增加在单细胞融合时产生各种杂交瘤细胞系的机会,为广谱性抗体的产生和筛选奠定了基础。混合抗原法一般是指以混合抗原作为免疫原进行免疫后,采集小鼠血清进行效价测定,选择产生高效价血清的小鼠,分离其脾细胞用于后续的细胞融合和筛选工作,利用间接ELISA筛选广谱性单克隆抗体(图2),将对应的杂交瘤细胞腹腔注射到小鼠体内,大量生产目标广谱性单克隆抗体。除产生广谱性抗体之外,混合抗原法还能产生对单个抗原特异性更高的单克隆抗体,可以同时满足对这2种抗体的需求。

混合抗原法已经应用于较多的领域。LIU等[10]采用氟喹诺酮类药物的6种人工合成抗原的混合物作为免疫原(每种免疫原0.5 mg),筛选得到一株广谱性单克隆抗体,该株抗体除不识别氟甲喹外,针对其他5种免疫原的IC50分别为0.1～132.28 ng/mL。DONG等[11]采用7种苏云金杆菌Cry1类毒素的混合物(每种毒素各70 μg)作为免疫原进行免疫后,采用间接ELISA筛选得到一株能识别7种Cry1毒素的广谱性抗体,采用双抗夹心ELISA法进行测定,其针对7种毒素的检出限在6.37～11.35 ng/mL。PENG等[12]通过在诺氟沙星和沙氟沙星的哌嗪环上引入6-溴己酸,使抗原抗体相互作用的关键表位即 3位羧基和1位烷基充分暴露制得诺氟沙星衍生物和沙氟沙星衍生物,以衍生物的混合物作为半抗原,最终免疫制得了能识别32种(氟)喹诺酮类抗生素的广谱性抗体。

采用混合抗原法制备广谱性抗体具有简单高效的特点,但存在一些问题,如混合抗原中每种抗原的免疫原性不同,优势抗原往往产生高亲和力的抗体,而免疫原性弱的抗原产生的抗体亲和力较低或丢失[13]。

图2 采用混合抗原免疫动物后制备广谱性单克隆抗体Fig.2 Preparation of broad-spectrum monoclonal antibodies by immunizing animals with mixed antigens

1.2 多重抗原法

多重抗原是指几种半抗原与单个蛋白质载体分子偶联所得的免疫原,因此也被称为多抗原表位抗原。多重抗原法将选择共有结构的过程“设计”到抗原抗体特异识别的免疫过程中,通过多个抗原决定簇的筛选作用得到广谱性抗体(图3)。相较于在半抗原设计过程中寻找“共性”的通用型结构抗原,通过控制与载体蛋白结合的半抗原的种类,可以确定诱导所产生抗体的识别谱,如果结合通用型半抗原技术,则能进一步拓宽抗体的识别谱,可以满足对不同危害物和特殊产品的检测需求。WANG等[14]将4种不同农药的半抗原偶联至牛血清白蛋白制备多重抗原,筛选得到的抗体对4种农药半抗原的IC50分别为 0.29、0.07、0.58和2.82 μg/mL。ZHANG等[15]以对硫磷半抗原和吡虫啉半抗原分别与牛血清白蛋白偶联制备多抗原表位免疫原,建立了一种基于广谱多克隆抗体的异源间接竞争酶联免疫吸附检测法,用于对硫磷和吡虫啉的检测。

制备多半抗原免疫原时,较难控制不同半抗原与载体蛋白的偶联比,导致产生的抗体对不同分析物的亲和力不一致且较低。虽然高剂量的免疫原在一定程度上有利于拓宽抗体的识别谱[16],但广谱性抗体的亲和力也会随着多半抗原免疫原中半抗原数量的增加而降低,很可能是因为多半抗原免疫原的表面不利于淋巴细胞对载体蛋白的识别,导致免疫系统诱导不良[17]。因此,目前仍无法获得具有同等效力且亲和力较高的最佳多重免疫原。

图3 采用多半抗原免疫原制备广谱性抗体Fig.3 Preparation of broad-spectrum antibodies with multi-hapten immunogens

1.3 基于共同抗原表位的通用型结构抗原法

同一类污染物如农兽药残留和真菌毒素,具有相同的母体结构。采用结构类似物的母体结构进行半抗原的设计,并制备完全抗原,免疫动物后所得到的抗体往往可以同时识别多种具有免疫原母体结构的危害物。通用型结构抗原的设计合成一般包括半抗原的设计、半抗原与载体蛋白偶联成完整抗原及免疫产生抗体三步。选择合适的半抗原是制备广谱性抗体和开发广谱性免疫分析方法的关键步骤,而结构相似性是选择半抗原的基础[18],因此,以某些结构类似物共有的“中心基团”为分子模板,结合分子大小、立体化学、电子特性、活性基团、活性位点等指标设计半抗原是较为常用的方式。小分子污染物通过肟化活泼酯法、氨甲基化法、混合酸酐法、环氧化物法、半缩醛法、烯醇醚衍生物法与载体蛋白偶联得到完全抗原后通过免疫、细胞融合及筛选即可得到相应的广谱性抗体[19]。MARI等[20]通过对硝呋喃嗪代谢物进行分子改造合成半抗原,通过偶联载体蛋白得到完全抗原,免疫后最终获得能识别 4 种鸡体内4-羟基苯肼的广谱单克隆抗体。

随着计算科学、量子化学、分子动力学等学科理论的发展,以及分子模拟技术、计算机辅助技术、网络数据库分析技术等的进步,建模式半抗原的制备也逐渐成为研究热点,通过数据库检索氨基酸序列、相关软件比较确定高度相似序列,进而通过专业网站建模、评估,找出某些结构类似物的重叠区域,即为所需要的目标序列,表达纯化后即可得到相应的“人工”半抗原。如DONG等[21]从GenBank中检索出7种主要的苏云金杆菌Cry1类毒素：Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1E和Cry1F的氨基酸序列,利用DNAMAN软件进行比较,确定高度相似的序列,利用DNA Star软件计算抗原表位的抗原性和亲水性,将Cry1Aa和Cry1Ac的X射线晶体结构作为模型,由SWISS-MODEL网站建模,并通过Ra machadran plot、ERRAT和Verify 3D进行评估,然后用SWISS-Pdb Viewer 4.1.0软件对模型进行分析,找出7种Cry1毒素的重叠区域。综合考虑这些分析结果,确定了序列和空间构象相似性高、抗原性和亲水性强的目标序列,并合成多肽。以合成的多肽作为半抗原,最终制备了一种能同时识别7种主要Cry1类毒素的单克隆抗体,且具有较好的亲和力(1.36×10-8～5.17×10-8mol/L)(图4)。

1.4 通过基因突变提高广谱性抗体的广谱性和亲和力

通过前文所述的3种方法获得广谱性抗体后,可以借助基因突变等基因工程技术进一步提高广谱性抗体的广谱性和亲和力,基因突变主要分为随机突变和定点突变2种(图5)。

简便、快速的随机突变方法结合有效的筛选策略(如借助噬菌体展示技术或核糖体展示技术进行筛选)有助于获得亲和力更高的抗体。LEIVO等[22]通过随机突变使得一种识别喹诺酮类药物的抗体的亲和力显著提高,使其对沙氟沙星的IC50降低20倍以上,对马波沙星的IC50降低近3倍。

通过预测抗原抗体识别的关键氨基酸位点,并利用定点突变的方法将目标氨基酸的1 个位置或多个位置被其他19种氨基酸随机替换,从而使抗体的广谱性及亲和力发生变化,选择突变后广谱性和亲和力均提高的抗体,这种改性的方法同样也适用于广谱性抗体。WEN等[23]为了制备能够识别喹诺酮类药物的通用抗体,以诺氟沙星单克隆抗体为基础制备了可识别17种常见的喹诺酮类药物的广谱性单链抗体,为了进一步提高其广谱性和亲和力,采用同源建模构建抗体的结构,分析了关键氨基酸残基并对抗体中的抗原互补决定区3(complementarity determining region 3,CDR3)的关键氨基酸进行定点突变,最终筛选得到了既保留了对以上17种喹诺酮类药物的广谱性,又可特异性识别沙拉沙星、二氟沙星和曲伐沙星的高亲和抗体。ZHONG等[24]利用定点突变的方法增强单链抗体的广谱性,最终获得一种可以识别5种Cry1Ab毒素的广谱性抗体突变体D9。JIAO等[25]采用同源建模和分子对接技术分析了Cry1Ab毒素单域抗体A8与5种Cry1毒素的关键氨基酸结合位点,然后对关键氨基酸进行位点饱和突变。最后筛选出针对多种Cry1毒素的高亲和力广谱性抗体,比亲本亲和力高20倍。

A-Cry1类毒素结构分析;B-探寻Cry1类毒素共有结构及氨基酸,合成多肽抗原并进行免疫;C-基于广谱性抗体的7种Cry1类毒素检测标准曲线分析图4 Cry1类毒素免疫原设计、合成及广谱性抗体制备Fig.4 Immunogen design, synthesis, and broad-spectrum antibody preparation of toxoid Cry1

近年来定点突变与虚拟突变和虚拟筛选的联合使用为提高广谱性抗体的亲和力提供了新的策略。WANG等[26]在已经制得的针对12种氟喹诺酮类药物的广谱性抗体的基础上,结合虚拟突变的结果,将单链抗体的 Tyr99 定向突变为 His,结果表明,突变体对12种药物的灵敏度提高了 7 倍,对 12 种药物的检测限为0.3～8.0 ng/mL。

同源建模及分子对接等生物信息学技术的发展虽然使得构建的结构模型的准确性得到了显著提高,但其构建的三维模型与真实的结构仍然存在差异,并不能完全反映其真实结构,仍存在一定的发展空间。

图5 提高广谱性抗体的广谱性和亲和力的主要方法Fig.5 Main methods for improving the corss-reactivity and affinity of broad-spectrum antibodies

2 广谱性抗体在食品安全快速检测中的应用现状

2.1 食品中毒素类危害物的检测

食品中毒素类危害物种类繁多,真菌毒素和藻类毒素是食物中主要的2种生物毒素。真菌毒素的主要种类有黄曲霉毒素(aflatoxins,AFS)、玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)、脱氧雪腐镰刀菌醇(deoxyni- valenol,DON)等,其普遍存在于玉米、大米、小麦、油、牛奶、水果及相关加工产品中,大部分真菌毒素具有致癌、致畸性、致突变、免疫毒性、肝毒性、神经毒性、皮肤毒性等多种毒性作用[27]。藻类毒素主要包括肝毒素、神经毒素和内毒素,藻类毒素能够引起腹泻、神经麻痹、肝损伤、中毒甚至死亡[28]。因此食品中的真菌毒素、藻类毒素的高通量检测对保障食品安全具有重要意义。每一类毒素的结构相似性(如ZEN都有与雌激素相似的结构;AFS基本结构中都有二呋喃环和氧杂萘邻酮[19]等)为广谱性抗体的创制及应用提供了可行性。

WANG等[29]根据ZEN的分子结构和活性部位,设计了人工抗原,研究得出用肟化活性酯法制备免疫原ZEN-牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)免疫动物,获得的针对ZEN及其类似物的广谱性抗体最优,并且WANG等[30]利用该抗体建立了针对ZEN及其5个同系物的异源间接竞争性ELISA免疫检测法。张海棠等[19]根据黄曲霉毒素B1(AFB1)的分子结构和活性位点,合成人工抗原AFB1-BSA,最终制备出了高效价、灵敏、广谱的AFB1单克隆抗体。LU等[31]通过将微囊藻毒素(Microcystin,MC)中的MC-LR和钥孔戚血蓝蛋白偶联,最终免疫获得能够同时检测9种微囊藻毒素和结核素的广谱性抗体,并通过异源包被策略来提高检测的灵敏度,最终建立了一种广谱、高灵敏的竞争性间接酶联免疫吸附检测法。

2.2 食品中农兽药残留的检测

农药用于控制、调节、预防或驱除影响植物生长的疾病、杂草、昆虫和害虫[32]。兽药在养殖实践中通常用于预防治疗疾病、促进动物生长。农药和兽药的合理使用可以防止农业和畜牧业的破坏性损失,从而满足全球人口增长的需求。然而,过度使用或滥用杀虫剂和兽药会导致这些物质在食品中残留,并通过食物链进入人体,产生累积毒性、细菌耐药性等一系列危害,对人体健康构成威胁,因此,农药和兽药残留的高效检测是一个重要的全球性食品安全问题[33]。大部分农兽药均属于家族类小分子化合物,因此,广谱性抗体的应用为农兽药残留提供了新的高效检测思路。

SHI等[34]制备了一种可以同时识别氯丙嗪、异丙嗪、乙酰丙嗪等5种吩噻嗪类药物的广谱单克隆抗体,并利用定点诱变技术将抗体轻链互补决定区2的Phe 164突变为Pro 164,制得了一种单链抗体基因突变体,突变体对5种药物的亲和力得到较大提升。LI等[35]利用合理设计的4-[(4-氨基苯基)磺酰基-氨基]-2-甲氧基苯甲酸半抗原与牛血清白蛋白进行生物偶联,制备了抗磺胺类药物的广谱、高亲和力的多克隆抗体(pAb)[35]。GALVIDIS等[36]将2种具有广谱性的单克隆抗体结合使用,建立了一种双竞争性夹心酶联免疫吸附检测法,该法适用于测定14种磺胺类药物的最大残留限量浓度。CHEN等[37]研究了喹诺酮类药物与以吡哌酸为半抗原所产生抗体之间的交叉反应性,并与已报道的交叉反应性数据及半抗原组成进行比较,分析了抗原抗体的三维定量结构-活性关系,结果表明,形状像字母“Y”的半抗原构象对于产生具有广谱性和高交叉反应性的抗体具有关键作用,该研究结果对准确设计半抗原、预测抗体的特异性以及更好地理解抗原和抗体之间的识别机制具有重要意义。LIU等[38]利用分子模型和主成分分析选择合适的半抗原,最终建立了一种针对10种三嗪类除草剂的广谱性异源免疫测定法。王弘等[39]从噬菌体展示纳米抗体文库中筛选得到了一种针对二乙氧基有机磷农药的纳米抗体,该纳米抗体能够检测多种二乙氧基有机磷,且检测结果准确、稳定性好。YIN等[40]针对α-玉米赤霉醇(α-zearalanol,α-ZAL)类化合物的结构特点,制备出可同时识别6种α-ZAL类化合物的高灵敏广谱单克隆抗体,建立了能同时检测多种α-ZAL类化合物的酶联免疫吸附法。WANG等[41]根据全息图和三维定量结构-活性关系得出β-激动剂半抗原上有2个影响抗体特异性的关键结合表位,且C-2′表位上的叔丁基是产生广谱性抗体的必要条件,本研究最终开发了一种可用于识别23种β-激动剂和类似物的竞争抑制酶联免疫吸附检测法。表1为更详细的广谱性抗体在农兽药残留检测中的应用举例。

表1 广谱性抗体在农兽药残留检测中的应用Table 1 Application of broad-spectrum antibodies in detection of pesticide and veterinary drug residues

2.3 其他

除了在毒素污染和农药残留检测方面的应用,广谱性抗体还被广泛应用于其他多种危害物的高通量检测,如作为口服药使用的磺酰脲类药物、混入食物中的植物毒素生物碱、肉类食品中的蛋白质经加工后产生的杂环胺、作为抗生素的青霉素、动物体内的雄激素等。

磺酰脲类药物是一类广泛应用于临床治疗的降2型糖尿病药物,然而,近年来,为了改善声称的抗糖尿病活性,人们往往在多种草药茶中非法掺假。当处于最低能量构象时,所有的磺酰脲类药物都具有相似的J型构象和分子静电势等值面。XIE等[51]合理设计了一种新型半抗原,并开发出一种可以识别9种磺脲类药物的广谱性单克隆抗体,为多种凉茶产品中非法掺假成分的现场检测提供了一种高效快速的方法。生物碱大多数有复杂的环状结构,氮素多包含在环内,有显著的生物活性。WANG等[52]通过研究10种主要生物碱及其代谢物的结构选取合适的半抗原,最终得到了一种广谱的抗生物碱单克隆抗体,并以此为基础开发了一种间接竞争性酶联免疫吸附检测法,可以用于快速筛查猪尿、猪肉和谷类面粉样品中的阿托品、东莨菪碱、高阿托品、茴香碱、茴香碱和L-羟胺的残留。杂环胺(heterocyclic aromatic amines,HAAs)是在高温烹调加工各种蛋白质含量丰富的食品时产生的一类具有致突变、致癌作用的物质,研究表明,长期食用含杂环胺的熟肉制品,可增加癌症的发生率,特别是结、直肠部位。SHENG等[53]通过合成半抗原最终得到一种可以同时测定8种HAAs的广谱性抗体,用于检测加热处理肉类中的杂环胺残留。青霉素是最常用的一类广谱抗生素,含有共同的母核结构,不同的青霉素之间由不同侧链结构予以区分,兽医临床上常把它作为消炎抗感染的首选药使用,但治疗人员为了追求治疗效果,出现了滥用或超剂量使用的现象,造成药物在动物体内的残留[54]。刘伟怡等[55]通过活泼酯法将青霉素G(penicillin,PEN)合成人工抗原PEN-BSA和PEN-卵清蛋白,将PEN-BSA免疫新西兰大白兔获得可以同时测定8种青霉素类抗生素的多克隆抗体,并建立了异源ELISA检测法用于测定牛奶中青霉素类抗生素的残留。动物可食用组织中雄激素的残留具有多种危害,如造成头痛、胸闷、心悸、肌肉疼痛、秃发、内分泌紊乱、染色体畸变和生殖毒性。雄激素是常见的甾体结构化合物之一,主要区别在C-17或C-19位的甲基末端取代基上,不同的雄激素在空间构象上具有一定的相似性,这为通用抗体的制备提供了可能。GAO等[56]使用MT-CMO-KL作为半抗原制备广谱性抗体,最终开发了一种准确度高的用于检测动物可食用组织中多种雄激素残留物的间接竞争酶联免疫分析方法。

由上可知,某一类危害物的结构相似性为广谱性抗体的制备及应用提供了理论依据,针对更多危害物的广谱免疫学检测法也将因其“高效、经济、简便”的特点得到更广泛的应用,为不同领域带来经济安全双效益保障。

3 广谱性抗体在食品安全快速检测领域的发展趋势

广谱性抗体在食品安全领域的开发与应用目前主要有2个问题:(1)半抗原设计盲目性仍较高,“试错”法仍然是大部分研究所用的方法;(2)广谱性抗体的检测灵敏度普遍较低,一些创新性的研究针对这2个问题做出了解答,同时也对广谱性抗体的未来研究方向有一定的指导作用。

尽管制备广谱性抗体有多种方法,但是通用型结构抗原法是使用最广泛的方法,半抗原的设计是该法中的关键性步骤,目前大多数研究中仍然使用二维的共性结构分析加实验“试错”的方法筛选所需的半抗原,由于抗原的立体化学和电子性质在与抗体的相互作用中起着重要作用,因此半抗原的设计不应仅考虑二维结构,还应考虑三维构象以及是否容易获得等多个因素[35]。虽然传统方式也可以进一步结合多方面的信息进行精细筛选,但是能够模拟特定抗体的交叉反应细节且成本低的建模方式,是改进传统“试错式”半抗原设计更好的选择。同时,了解抗原抗体的识别机制对于提高广谱性抗体的性能以及指导免疫分析方法的建立具有重要作用。

目前广谱性抗体的检测灵敏度并不理想,这与所用的筛选策略和建立的检测方法均有关,如研究表明非竞争性免疫检测法、异源性检测方法均可以在一定程度上提高检测灵敏度。