高效液相色谱法测定甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂中间体3-异色酮的质量分数

王睿，贺芳，李俊，周世阳

（1.贵州省检测技术研究应用中心，贵州 贵阳 550014；2.贵阳市白云区疾病预防控制中心，贵州 贵阳 550016）

3-异色酮，又叫 3-异色满酮、3-异苯并二氢吡喃酮，CAS号4385-35-7，分子式C9H8O2，相对分子质量148.16，熔点83 ℃，沸点130 ℃。其化学结构见图1。

图1 3-异色酮化学结构式

甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是目前全球销量最高的保护性杀菌剂，是化学保护性杀菌剂中持效期最长的成分。该类杀菌剂内吸活性好，具有低毒、高效、广谱杀菌、环境友好等特点，是世界农药界继三唑类杀菌剂后又一类极具发展潜力和市场活力的新型农用杀菌剂，主要产品有嘧菌酯、醚菌酯、肟菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、氟嘧菌酯等。随着下游产品的市场需求量增加，3-异色酮又作为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂活性基团的重要合成中间体原料，化工市场对3-异色酮的需求量也不断增大[1-6]。当前，暂无相关标准和文献对3-异色酮分析检测方法进行报道，本试验建立了一种对3-异色酮进行定量的高效液相色谱分析方法，简单模拟了在环境中（土壤和水体中）检测3-异色酮的基本处理方法，该方法操作简单，拥有良好的分离效果和线性关系，且精密度和回收率均符合要求，适用于对3-异色酮进行环境安全性评价时的质量分数测定，也适用于生产企业在中间体生产和反应终端杂质控制的质量把关。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

沃特世e2695型高效液相色谱仪，配置了可变波长的二级阵列管检测器；Empower3色谱数据处理工作站；梅特勒-托利多ME204E型电子分析天平；默克-密理博纯水仪；XW-80A漩涡混合器；Merck KGaA色谱纯乙腈、Milli-Q超纯水、3-异色酮标准物质（纯度≥ 99.1%）。

试验水体基质：用1 L磨口棕色玻璃瓶采集水样，采样前经严格清洗，并用热风吹干后置于洁净的环境中冷却待用。采样时需将水样注满用锡箔纸封口。样品运输过程中置于加有冰块的保温桶中并确保冰块不解冻。水样带回实验室先用滤纸过滤去除水中大颗粒悬浮物及微生物，试验分析前过0.45 μm滤膜，样品置于4 ℃冰箱中存放，30天内完成分析。

试验土壤基质：用可以封口的布袋采集土样，采样前经严格清洗，并用热风吹干后置于洁净的环境中待用。土壤样品采集于贵州省关岭县断桥镇半岭村水稻田土壤，按照随机布点法采集林地表层0~20 cm土壤，取10个点混合约2 kg，装于可以封口的干净布袋中，并与口袋内外分别附上土壤采样信息标签。采集的土壤带回实验室后均匀平摊在干净白布上，捡出石砾、枯枝落叶、树根等杂物，置于干燥、阴凉、通风的环境下自然风干。将土样研磨并过60目（0.25 mm）筛，制成粉末状样品，收集制备好的土壤置于1 L磨口棕色玻璃瓶内保存。

1.2 高效液相色谱操作条件

流动相为乙腈-超纯水（体积比70∶30），柱温为 35 ℃，流速为 1.0 mL·min-1，进样体积为 10 μL，检测器波长为210 nm，色谱柱为岛津GL Sciences Inertsil ODS-SP 250×4.6 mm，5 μm，3-异色酮保留时间约为3.6 min，典型色谱图如图2所示。

图2 3-异色酮标样色谱图

1.3 实验步骤

1.3.1 标样溶液的配制

精确称取0.010 2 g 3-异色酮于100 mL的烧杯中，用少量乙腈溶解并少量多次洗涤烧杯并转移至100 mL的容量瓶中，再用乙腈定容至刻度，配制成质量浓度为 101.082 mg·L-1的 3-异色酮储备液，置于室温保存。

1.3.2 3-异色酮工作液的配制

用乙腈稀释 1.3.1配制的 3-异色酮标样溶液，分别配制质量浓度为20.216、10.108、5.054、2.527、1.011、0.505 mg·L-1的 3-异色酮工作溶液。

1.3.3 样品处理

土壤加标回收率样品：称取1.00 g制备好的土壤于25 mL的比色管中，分别向其中加入101.082、20.216、10.108 mg·L-1的 3-异色酮标样溶液 1.0 mL，制成 3-异色酮质量分数分别为 101.082、20.216、10.108 mg·kg-1的3种土壤加标样品，每个质量分数样品均平行制作3份，同时做土壤空白试验。加入乙腈定容至10 mL刻度线，漩涡混匀2 min，静置待土壤全部沉于比色管底部，取 1~1.5 mL上清液过0.45 μm有机滤膜，在1.2液相色谱条件下进行测定。

水体加标回收率样品：取水样约8 mL于25 mL的比色管中，分别向其中加入 101.082、20.216、10.108 mg·L-1的3-异色酮标样溶液1.0 mL，使用水定容至10 mL刻度线，振荡混合均匀，每个质量浓度样品均平行制作3份，制成3-异色酮质量浓度分别为 101.082、20.216、10.108 mg·L-1的水体加标样品，同时做水体空白对照。取 1~1.5 mL溶液过0.45 μm水系滤膜，在1.2液相色谱条件下进行测定。

1.3.4 测定

选取0.505~20.216 mg·L-1的工作溶液用于制作校正曲线，质量浓度为 1.011 mg·L-1的 3-异色酮标液用于仪器精密度实验，0.505 mg·L-1的3-异色酮标液用于检出限和定量限实验。

1.3.5 计算

本方法采用外标法对3-异色酮进行定量计算，工作曲线公式为：

式中：y—色谱峰响应的峰面积；

x—3-异色酮的质量浓度，mg·L-1；

a—工作曲线的斜率；

b—工作曲线的截距。

2 结果与讨论

2.1 分析条件的确定

根据3-异色酮的结构式，使用二级阵列管检测器将检测波长调整为波长扫描范围为190~400 nm，并对3-异色酮标样进行3D谱图扫描，确定在检测波长210 nm下，3-异色酮有较大吸收和较高灵敏度且受到的干扰较少；为避开溶剂的截止波长可能对3-异色酮造成的干扰，故首选乙腈作为溶剂；选用GL Sciences ODS-SP柱，在1.2色谱条件下，得到3-异色酮峰型尖锐对称，出峰时间点附近无干扰峰存在。

2.2 线性相关性测定

在1.2的液相色谱条件下，将1.3.2中的标准工作溶液重复分析3次，取平均值，分析结果见表1。由表1可以看出，当 3-异色酮在质量浓度0.505~20.216 mg·L-1范围时，质量浓度与色谱峰面积成良好线性关系，得到3-异色酮的线性回归方程为y=2.91×104x+9.34×103，线性相关系数R2为 0.999；以3-异色酮质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，见图3。

表1 线性相关性测定结果

图3 3-异色酮线性关系曲线

2.3 分析方法的精密度

取1.011 mg·L-1的3-异色酮工作溶液用于方法精密度试验，在1.2的液相色谱条件下重复分析6次，分析结果见表2。RSD（保留时间）＝0.1%，RSD（峰面积）＝0.8%，满足定性分析和定量分析的基本要求。

表2 分析方法的精密度测定结果

2.4 检出限和定量限

选取 0.505 mg·L-1的 3-异色酮工作溶液用于检出限和定量限实验，在1.2的液相色谱条件下平行分析6次，分析结果见表3。

表3 分析方法的精密度测定结果

由信噪比（S/N）计算出检出限（LOD）和定量限（LOQ），6次分析平均结果的LOD为3.55×10-1mg·L-1，LOQ为 1.18 mg·L-1。

2.5 加标回收率试验

采取向空白基质添加标准溶液的方法进行加标回收率试验，取1.0 g按1.1处理好的土壤和水体基质，按照1.3.3进行土壤和水体的加标样品处理，并在1.2的液相色谱条件下进行测定，分析结果见表4、表5。结果显示，3种不同质量浓度的3-异色酮在土壤中的加标回收率在84.2%~100.0%之间，回收率标准偏差小于3.159%；3种不同质量浓度的3-异色酮在水体中的加标回收率在85.0%~93.9%之间，回收率准偏差小于3.620%，说明该方法有良好的准确度，满足实验要求。

表4 回收率试验结果（土壤）

表5 回收率试验结果（水体）

3 结 论

本试验建立了甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂重要中间体3-异色酮的高效液相色谱分析方法，该方法操作简单，拥有良好的分离效果和线性关系，且精密度和回收率均符合要求，适用于对3-异色酮进行环境安全性评价时的质量分数测定，也适用于生产企业在中间体生产和反应终端杂质控制的质量把关。