不同方法提取沙苑子粗蛋白及DPPH自由基清除活性研究

樊轻亚，汪学猛

（信阳职业技术学院，河南 信阳 464000）

沙苑子为豆科一年生草本植物扁茎黄芪的成熟种子，内含蛋白质、多肽，黄酮类、鞣质、维生素A类物质等化学成分。研究表明，其具有抗衰老、抗肿瘤、调脂和保肝等作用[1-6]。此外，沙苑子也有明显的体外抗氧化活性。相对药材黄芪来说，沙苑子的研究尚处起步阶段，随着黄芪种植面积的加大，沙苑子的产量也随之增加，多余资源的开发问题将提上日程。

自由基学说认为，自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因。因此有效的自由基清除剂一直是近年的研究热点。植物中含有众多消除活性氧自由基的抗氧化类功能因子，从植物中寻找高效、廉价、低毒的天然抗氧化剂成为目前发展的一个必然趋势[7-10]。本文旨在探索从沙苑子中提取蛋白质的最佳条件，并对其体外内抗氧化能力方面的药用价值进行研究，为其在功能食品、保健食品、化妆品和药品等方面的应用提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Cary 50 紫外分光光度计（美国Varian公司）；RE-5205型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；LGJ-10B型冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂）；数显恒温水浴锅（上海申胜生物技术有限公司）；KDC-1044低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH，Fluka公司）；抗坏血酸对照品（中国食品药品检定研究院）；盐酸、氢氧化钠、石油醚、无水乙醇均为分析纯。沙苑子，安徽亳州药材市场。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白质自提取实验

1）材料预处理。取材料沙苑子粉碎，过2号筛，粉末用滤纸包好置入索氏提取器中用石油醚（30~60 ℃）浸泡1夜，次日，于水浴锅在46 ℃回流提取，提取时间24 h，最大量的除去油脂，提取液回收石油醚及油，渣晾干，备用。

2）蛋白质提取方法。采用碱提酸沉法从沙苑子中提取分离蛋白质。工艺流程：籽料→除杂→粉碎→过筛→碱液提取→离心→上清液调酸→过滤→沉淀干燥→成品。

3）常温磁力搅拌法。称取10 g渣料，加入一定比例的蒸馏水，搅拌均匀，用1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值为10～11，常温磁力搅拌1 h，低速离心4 000 r·min-1离心10 min，残渣重新提取，合并两次上清液。

4）加热磁力搅拌法。称取10 g渣料，加入一定比例的蒸馏水，搅拌均匀，用1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值为10～11，50 ℃条件下磁力搅拌1 h，离心取沉淀，残渣重新提取，合并两次上清液。

5）常温超声提取法。称取10 g渣料，加入一定比例的蒸馏水，搅拌均匀，用1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值为10～11，超声提取1 h，低速离心10 min，残渣重新提取，合并两次上清液。

6）加热超声提取法 称取10 g渣料，加入一定比例蒸馏水，搅拌均匀，用1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值为10～11，50 ℃超声提取1 h，离心取沉淀，残渣重新提取，合并两次上清液。

7）将上述常温磁力搅拌、加热磁力搅拌、常温超声提取、加热超声提取的上清液，分别加1 mol·L-1盐酸调节pH值至2～3，放冰箱静置1夜。离心取沉淀，用1 mol·L-1NaOH溶液调节pH值为中性，冷冻干燥24 h、称重，得棕色沙苑子蛋白质。

1.2.2 粗蛋白得率计算方法

式中：m1—干燥后蛋白质质量；

m2—提取前原料质量。

1.2.3 抗氧化实验[11-13]

1）溶液配制。称取0.039 4 g DPPH, 用无水乙醇配制成浓度为0.001 mol·L-1DPPH溶液。

称取0.005 g蛋白质提取物，用无水乙醇定容配制成质量浓度分别为 0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 g·L-1样品溶液。

称取0.005 g抗坏血酸，用无水乙醇定容配制成质量浓度分别为0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 g·L-1抗坏血酸溶液，避光保存。

2） 清除DPPH自由基 以抗坏血酸作为阳性对照，根据呈深紫色的DPPH 甲醇溶液，在最大吸收峰 517 nm 处褪色程度测定沙苑子蛋白质的DPPH 清除能力。

DPPH自由基清除率计算式：

式中：At—样品和DPPH混合液的吸光度；

A0—溶剂和DPPH混合液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法对沙苑子蛋白得率和蛋白纯度的影响

由图1（a）可见，不同的提取方式对于沙苑子的蛋白质得率有影响，磁力搅拌随着温度的提高，得率有所增加；而超声提取时，随着温度的提高，蛋白质反而下降。

图1 不同提取方法对沙苑子的蛋白得率（a）和蛋白质纯度（b）的影响

由图1（b）可见，不同的提取方式对于沙苑子的蛋白质纯度影响颇大，在常温磁力搅拌条件下，蛋白质纯度较高，达78%；伴随温度的提高，纯度有所下降；而超声提取时，伴随温度的提高，蛋白质纯度下降。总体磁力搅拌所得蛋白质纯度均高于超声提取法所得蛋白质；温度提高，可能影响到蛋白质的稳定性，故纯度均降低。

综图1所示，沙苑子粗蛋白的得率与纯度与提取温度有直接关系，超过30 ℃，蛋白质纯度降低，故提取时尽量保持常温；冷藏和冷冻时也需控制温度，否则蛋白质变性影响后期实验的结果。

2.2 不同提取方法对主要氨基酸的影响

由图2可见，不同方法得到的粗蛋白中必需氨基酸有不同程度变化，随温度升高，提取率有所增加，其中磁力搅拌法提取氨基酸的效率高于超声提取。

图2 不同提取方法得到的粗蛋白中必需氨基酸含量（g·100 g-1）

但对比黑豆、黄豆的营养成分，沙苑子中的甲硫氨酸含量很高，对养殖方面是一种优秀的资源，值得开发。

2.3 DPPH自由基的清除作用

抗坏血酸质量浓度和蛋白质提取物质量浓度对DPPH自由基清除率的影响见图3。

由图3（a）可见，DPPH自由基清除率随抗坏血酸浓度的增加而增加。由图3（b）可见，沙苑子蛋白质对DPPH自由基的清除率随提取物质量浓度的增加而增加，表明沙苑子粗蛋白有明显的清除作用，在其质量浓度为 0.1 g·L-1时，清除率高达50.64%，表明沙苑子粗蛋白可作为抗氧化药物和保健品的资源。

图3 抗坏血酸质量浓度（a）和沙苑子蛋白质量浓度（b）对DPPH自由基清除率的影响

3 结 论

本文用碱提酸沉法辅助不同的提取方式，考察蛋白质最佳提取方案，为沙苑子蛋白质开发打下良好的基础。本文研究表明，沙苑子清除自由基的能力与其蛋白含量有关，据此推断沙苑子改善血液流变学指标、抗衰老、降脂保肝、抑制血小板聚集、增强免疫功能等作用也可能与其抗氧化活性和蛋白质含量有关。后继可进一步开发沙苑子的有效成分，揭示沙苑子的药理作用机制，促进沙苑子资源的开发利用。