基于LlNCS转录组数据以囊泡谷氨酸转运体1为靶点的抗阿尔茨海默病药物重定位

谢宗杰，王 静，韩 露，王同兴，高圣乔，程肖蕊，周文霞，张永祥

（1.南京中医药大学研究生学院，江苏 南京 210023；2.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850）

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种与衰老显著相关的神经退行性疾病，主要有认知障碍、记忆丧失和行为异常等临床特征。目前，治疗AD只有多奈哌齐（donepezil）、卡巴拉汀（rivastigmine）、加兰他敏（galanthamine）、美金刚（memantine）和美金刚-多奈哌齐（memantine ER/donepezil，Namzaric）5个药物，均获美国食品药品监督管理局批准上市，但它们只能在一定程度上缓解AD症状的加剧，疗效并不理想。2019年，国家药品监督管理局批准我国自主研制的糖类新药GV-971上市，在一定程度上填补了国产AD治疗药物的空白[1]。然而寻求更有效的AD治疗药物仍然是一个亟待解决的全球性难题。

谷氨酸能系统是脑内重要的神经信号传导系统之一，其功能的正常和稳定受脑内神经元和胶质细胞对谷氨酸合成、释放、摄取和代谢等多个环节的影响，其中任一环节异常均可导致局部谷氨酸浓度升高。突触间隙谷氨酸蓄积所引起的兴奋性毒性被认为是导致AD发生的机制之一[2]。美金刚作为N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA受体）拮抗剂，正是通过阻止过多的谷氨酸与兴奋性受体结合引起的兴奋性毒性发挥治疗AD的作用。囊泡谷氨酸转运体1（vesicular glutamate transporter 1，VGLUT1）位于谷氨酸能神经元的囊泡质膜上，能特异性地将胞浆中谷氨酸装填进囊泡中，是神经元释放谷氨酸的决定性因素之一。研究报道，银纳米粒子在诱导谷氨酸兴奋性毒性的同时伴随VGLUT1表达降低[3]，提示突触前转运谷氨酸进入囊泡的能力不足可能同样参与兴奋性毒性产生。而在AD相关研究中发现，β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）诱导淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）/早老蛋白1（presenilin-1，PS1）转基因小鼠均存在VGLUT1表达下降[4-6]，临床研究中也同样观察到AD患者脑内VGLUT1表达呈年龄依赖性下降现象[7]。本实验室前期研究发现，快速老化小鼠P8（senescence-accelerated mouse prone 8 strain，SAMP8）脑组织VGLUT1表达亦增龄性降低[8]，其原因一方面可能是引起降解VGLUT1的胱天蛋白酶3增加而造成突触前囊泡膜上VGLUT1减少，另一方面可能是突触后谷氨酸受体、清除突触间隙谷氨酸的转运体以及谷氨酸再合成相关酶表达降低，从而引起反馈，使得突触前囊泡膜上VGLUT1减少[9]。上述研究表明，作为控制囊泡中谷氨酸填充速度的VGLUT1表达下降可能是导致AD发生发展的重要因素之一。因此，本研究以VGLUT1为靶点进行抗AD药物重定位研究。

药物重定位技术作为一种周期短、风险低的新药发现策略，近年来得到了抗AD药物研发领域的青睐。截止2020年，全球约有30%在研抗AD药物采用了药物重定位的策略（Clinicaltrials.gov），其基本思想是“一药多靶”和“一靶多治”[10]。2006年，布罗德研究所（Broad Institute）提出的连接图（Connectivity Map，CMap）项目通过获取药物扰动后细胞基因表达谱信息，构建的“药物-基因-疾病的关联网络”在基于药物重定位药物研发策略中得到了广泛应用。通过比较药物对细胞基因表达谱扰动作用的相似性，研究人员成功发现了多种现有药物的新用途[11-12]。而鉴于CMap的成功应用，美国国立卫生研究院于2010年启动了该项目的升级版——基于网络细胞反应印记整合文库（the Library of Integrated Network-Based Cellular Signatures，LINCS）计划。截止2018年，LINCS计划公布了包含4万多种小分子化合物在不同剂量下与多个细胞系反应产生的上百万个细胞基因表达谱信息，这为基于药物基因关联网络的重定位策略提供了丰富的数据基础。通过分析候选药物对细胞基因表达谱的影响，如根据候选药物对细胞基因表达谱的扰动效果与已知药物的相似性，或根据药物对细胞基因表达谱的影响与疾病状态下的相反性，则可预测得到药物潜在的新功效。

本研究以VGLUT1为靶点，利用高可信度MetaCore数据库（https：//portal.genego.com/）构建VGLUT1的特征基因集合，通过计算VGLUT1特征基因集在LINCS中L1000平台收录的623种药物扰动基因表达谱中的富集情况，进行潜在靶向VGLUT1调控药物的快速筛选和预测，并以SAMP8为散发型AD（sporadic AD，SAD）模型，通过学习记忆行为学实验对所预测药物改善认知的作用进行初步验证，旨在为寻找AD治疗药物提供线索。

1 材料与方法

1.1 动物、药物和仪器

雄性SPF级SAMP8和抗快速老化小鼠（senescence-resistant mouse prone 1 strain，SAMR1），9月龄，体重28.5～40.5 g，繁殖于军事医学研究院实验动物中心，饲养环境温度为21～23℃，湿度为50%～60%，每日光照和黑暗各12 h，饲养期间所有小鼠自由饮水及进食。美金刚，北京偶合科技有限公司；米非司酮（mifepristone），国药集团化学试剂有限公司；以10 mL·kg-1的给药体积计算，实验开始前每次用容量瓶分别配制100 mL美金刚（1.0 g·L-1）和米非司酮（0.325 g·L-1）于4℃冰箱中保存待用，给药前取出适量并平衡至室温后再ig给药。Morris水迷宫装置（包括迷宫宫体）（DNS-2），中国医学科学院；新异物体识别装置（包括活动测试箱）（30 cm×30 cm×30 cm，黑色不透明有机玻璃箱），本室定制；学习物体（图1A和B，黑色实心锥体）、新物体（图1C和D，装有红色墨水的锥形瓶及装有黑色墨水的小细胞培养瓶）和SuperMaze动物行为学视频分析系统，上海欣欣信息科技有限公司。

Fig.1 Object used in object recognition memory test.A and B：two same objects for the learnning phase；C：novel object for the 1-hour test phase；D：novel object for the 24-hour test phase.

1.2 Metacore数据库和VGLUT1特征基因集抽取

MetaCore数据库是一个系统的生物信息知识库和分析工具，其收录内容主要包括分子相互作用、代谢物和毒理等信息及通路富集分析、基因与疾病关联分析等工具。MetaCore数据库的一大特点是其所收录的信息由大量专业科研人员进行人工数据校正，具有高精确度和高可信度。MetaCore数据库迄今已收录＞170万条分子相互作用信息，其中多数标记了明确的作用方向和机制（上调或下调、抑制或激活、拮抗或激动等）。因此，利用MetaCore数据库能够准确找到直接调控VGLUT1基因的相关分子，并可将这部分数据作为VGLUT1特征基因集。而为构建VGLUT1特征基因集，本研究使用MetaCore数据库（检索日期：2020年03月）并选用一步扩展算法（Expand by One Interaction Algorithm）（该算法能够将与VGLUT1直接相关的基因扩展出来），将对VGLUT1转录具有直接上调或下调作用的节点构建出来获得VGLUT1的特征基因集。

1.3 基于基因表达谱分析的VGLUT1靶向药物筛选

VGLUT1特征基因集反映相关的调控通路，为寻找能够对该通路具有正向调控作用的药物，本研究整理了LINCS计划的L1000平台中收录的623个常见药物对PC3细胞不同时间和不同浓度条件下完整的表达谱数据[13]。将上述药物表达谱基因的表达量相较于对照组的差异变化转化为z-score形式。由于VGLUT1转录调控基因对VGLUT1作用分为“激活”和“抑制”2种，因此如果某药物能够上调“激活”基因和下调“抑制”基因的表达，则其有望能够对VGLUT1的表达实现正向调节。本研究采用基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）[14-16]法，将“激活”类调控基因作为上调基因（upV），将“抑制”类基因作为下调基因（downV），计算在药物完整表达谱秩序列（profile ranked list，PRL）中的反映特征基因集富集程度指标富集分数（enrichment score，ES）值。GSEA法首先将完整表达谱基因z-score的排序转化为PRL形式，通过Kolmogorov-Smirnov检验计算VGLUT1特征基因集“激活”基因和“抑制”基因在药物表达谱PRL中累计分布程度的ESup和ESdown，然后综合考虑得到总体富集分数ES值，其范围在-1～1之间。ES值越高，表示药物促进VGLUT1转录程度越高，负值则表示抑制VGLUT1转录的倾向。

本研究使用基于Kolmogorov-Smirnov统计的GSEA法来量化VGLUT1特征基因集在被比较药物的表达谱PRL中的富集程度（包括顶部或底部），并将结果用ES呈现。本研究用｛upV，downV｝表示VGLUT1特征基因集的“激活”基因和“抑制”基因，用ESup和ESdown分别表示”激活”基因和“抑制”基因集在药物表达谱PRL中的富集程度。如PRL长度为m，且包含的n个基因在PRL中排名为R1，R2，R3，……，Rk，则可得如下ESup：

如a＞b，则ESup=a；如b＞a，则ESup=-b。

ESdown计算原理相同。包含上下调基因的总体ES表示为：

1.4 行为学评价

1.4.1 动物分组和处理

将小鼠在本实验室适应性饲养1周后进行自主活动性测试，随后依据自主活动性和体重将SAMP8随机分为对照组（n=12）、阳性药物美金刚组（ig，10 mg·kg-1，n=9）和米非司酮组（ig，3.25 mg·kg-1，n=9），同时设 SAMR1对照组（n=13）；SAMP8和SAMR1对照组ig给予去离子水10 mL·kg-1；每天1次，共3个月。米非司酮给药剂量参考临床剂量即每天25 mg，据《实验动物及人的体表面积比例表》换算而得。

1.4.2 Morris水迷宫实验测定小鼠空间学习记忆能力

参考Wang等[17-18]方法，在给药3个月后采用Morris水迷宫实验评价SAMP8和SAMR1空间学习记忆能力。实验分为定向航行阶段（空间学习期）和空间探索阶段（空间测试期）。在学习期记录逃避潜伏期，测试期记录逃避潜伏期、穿越平台次数和目标象限游泳时间。

1.4.3 新异物体识别实验测定小鼠物体识别记忆能力

参考Wang等[17]和 Leger等[19]等的方法，采用新异物体识别实验评价SAMP8和SAMR1的物体识别记忆能力。实验分为适应期、学习期和测试期。学习期所用物体为相同的黑色实体组合体A和B，1 h测试期采用的物体C为装有红色墨水的锥形瓶，24 h测试期采用的物体D为装有黑色墨水的小细胞培养瓶（图1）。记录指标分别为物体探索时间和偏好指数。偏好指数=新异物体探索时间/总探索时间。

1.4.4 统计学分析

实验结果数据以±s表示，采用Graphpad Prism 8.0软件进行统计学分析。分别采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Dunnettt检验进行多组和两组间比较。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 VGLUT1特征基因集构建

通过MetaCore数据库选用一步扩展算法对VGLUT1特征基因进行抽取，结果获得了16个对VGLUT1转录具有激活作用的基因，11个对VGLUT1转录具有抑制作用的基因（表1）。

Tab.1 Gene sets with direct regulatory effect on vesicular glutamate transporter 1（VGLUT1）transcription

2.2 基于LlNCS的促进VGLUT1转录候选药物预测及筛选

为寻找潜在的可上调VGLUT1表达的药物，本研究基于LINCS收录的药物表达谱信息，对VGLUT1特征基因集在药物扰动后表达谱上调基因的富集情况进行分析，以对VGLUT1调控基因集具有促进作用的药物为目标，对候选药物进行筛选预测。

富集分析所得ES值表示药物对VGLUT1调控通路的作用。正值表示可促进上调基因或抑制下调基因，即促进VGLUT1转录；负值表示可抑制上调基因或促进下调基因，即抑制VGLUT1转录；绝对值大小表示促进或抑制程度。预测结果中对VGLUT1转录具有潜在促进作用的药物排名前5的为氟尼缩松（flunisolide）、谷氨酰胺、阿那曲唑（anastrozole）、米非司酮和雷替曲塞（raltitrexed）（表2）。全部预测结果见附件《促进VGLUT1转录的药物预测》（http：//cjpt.magtechjournal.com/CN/item/downloadFile.do?id=10056）。

Tab.2 Top five drugs with potential to promote VGLUT1 transcription on PC3 cells

在GSEA结果（图2）中可见，upV主要富集于米非司酮的上调基因区域，downV主要富集于米非司酮的下调基因区域，提示米非司酮对VGLUT1调控通路具有促进作用，即可能促进其转录。

Fig.2 VGLUT1 gene sets in mifepristone gene expression profile.A：genes with up-regulated effect on the transcription of VGLUT1 in GESA（upV）；B：genes with down-regulated effect on the transcription of VGLUT1 in GESA（downV）.NES=-1.753.

2.3 米非司酮对SAMP8小鼠认知功能的影响

2.3.1 对SAMP8空间学习记忆的影响

Morris水迷宫实验时，除SAMR1组外，3组SAMP8均有4只死亡。实验结果（图3）显示，在空间学习期第3～6天及空间测试期，SAMP8逃避潜伏期均显著长于SAMR1（P＜0.01），且在空间测试期穿越平台次数和目标象限游泳时间均显著少于SAMR1（P＜0.01）。给予美金刚和米非司酮对SAMP8逃避潜伏期和穿越平台次数未产生明显影响，但SAMP8在目标象限的游泳时间均显著延长（P＜0.05）。提示SAMP8空间记忆能力出现损伤，美金刚和米非司酮均可显著改善SAMP8的空间记忆能力。

Fig.3 Effect of mifepristone on spatial learning and memory in senescence-accelerated mouse prone 8 strain（SAMP8）.SAMP8 were ig administrated with deionized water（100 mL·kg-1），memantine（10 mg·kg-1）and mifepristone（3.25 mg·kg-1），respectively.Senescence-accelerated mice resistant-1 strain（SAMR1）were ig administrated with deionized water（100 mL · kg-1）.Three months later，behavioral tests were conducted with Morris water maze.A：latency in learning phase；B：latency in probe phase；C：number of crossing platform in probe phase；D：swimming time in target quadrant in probe phase.x± s，n=13（SAMR1），8（SAMP8）and 5（SAP8+memantine and SAMP8+mifepristone）.＊＊P＜0.01，compared with SAMR1 group；#P＜0.05，compared with SAMP8 group.

2.3.2 对SAMP8物体识别记忆能力的影响

新异物体识别实验时，SAMR1组有4只死亡。实验结果（图4A）显示，学习期间受试小鼠对2个相同物体的探索时间相近，表明测试系统正确。学习后1和24 h分别更换新物体测试结果（图4B和C）显示，在1 h测试期时，各组小鼠偏好指数无明显差异；在24 h测试期时，SAMP8偏好指数显著低于SAMR1（P＜0.05），给予美金刚和米非司酮SAMP8未提高其偏好指数。

Fig.4 Effect of mifepristone on object recognition memory in SAMP8.See Fig.1 for the mouse treatment.A：exploring time in learning phase；B and C：preference index in 1 and 24 h after training，respectively.±s，n=9（SAMR1），8（SAMP8）and 5（SAP8+memantine and SAMP8+mifepristone）.＊P＜0.05，compared with SAMR1 group.

3 讨论

本研究以VGLUT1为靶点，通过MetaCore高可信度生物信息数据库获取对VGLUT1转录具有直接调控作用的特征基因集合，并进一步通过GESA富集分析得到VGLUT1特征基因集在LINCS计划中L1000平台收录的623个常见药物表达谱PRL中的累计分布程度，以富集分数ES值评估药物对VGLUT1转录潜在的促进或抑制作用。结果显示，VGLUT1调控基因集在氟尼缩松、谷氨酰胺、阿那曲唑、米非司酮和雷替曲塞5个药物中具有较高的富集得分，它们对VGLUT1转录可能具有促进作用。

氟尼缩松是一种具有抗炎作用皮质类固醇，临床上主要用于过敏性鼻炎和哮喘。雷替曲塞是一种用于化疗的抗代谢药物，是一种胸苷酸合酶抑制剂。目前暂无两者与AD或认知功能相关的研究报道。阿那曲唑是一种非甾体芳香酶抑制剂，是临床上治疗绝经后女性乳腺癌的首选内分泌药物。据报道，阿那曲唑给药增加雌性APP/PS1/Tau三转基因小鼠脑内Aβ斑块面积[20]，可能是雌激素对AD典型病理特征的影响。谷氨酰胺作为一种非必需氨基酸，广泛存在于全身，参与多种代谢过程。最近有研究报道，谷氨酰胺可通过激活Wnt3a/β联蛋白信号通路改善SAMP8氧化应激损伤和在跳台实验中的学习记忆能力[21]。米非司酮是一种强抗孕激素和糖皮质激素受体拮抗剂，目前临床上用于抗早孕以及治疗糖皮质激素分泌过多导致的库欣综合征（Cushing syndrome）。Baglietto-Vargas 等[22]研究认为，循环糖皮质激素增多与衰老和AD有关，糖皮质激素过高可导致APP错误剪切，加速Aβ沉积，引起Tau蛋白过度磷酸化。而米非司酮可通过诱导APP裂解为17 ku片段阻止Aβ形成，并降低Tau蛋白磷酸化，改善APP/PS1/Tau三转基因AD模型小鼠空间学习记忆能力。此外，Pedrazzoli等[23]同样发现，米非司酮具有抑制APP/PS1/Tau三转基因AD模型小鼠脑内小胶质细胞活化和增加树突棘密度的作用。上述研究提示，米非司酮具有成为抗AD药物的潜力，但其对AD模型动物和AD患者谷氨酸能系统的调节作用尚未见报道。

不同AD模型动物如家族型AD模型APP/PS1转基因小鼠以及Aβ诱导的AD模型小鼠脑内VGLUT1表达均降低[4-6]，且AD患者脑内VGLUT1表达亦呈年龄依赖性下降[7]，表明作为谷氨酸能神经传递系统的重要参与者，VGLUT1对AD发生发展具有重要意义。本研究结果表明，米非司酮对VGLUT1调控基因集具有正向促进作用，即具有促进VGLUT1转录的作用。本实验室前期研究结果表明，SAD模型SAMP8脑内谷氨酸能神经传递异常，表现为兴奋性毒性和VGLUT1表达降低[9]。本研究以SAMP8为模型，发现米非司酮具有提高SAMP8空间学习记忆能力的作用，进一步验证了其抗AD作用，并提示通过上调VGLUT1表达维持谷氨酸能系统稳定可能是其发挥抗AD作用机制之一。但由于SAMP8加速老化和寿命较短的局限导致实验过程中SAMP8死亡，行为学实验中阳性药美金刚和米非司酮组只有5只小鼠，所得阳性结果还需进一步验证，但对于重定位预测结果仍具有一定的参考价值。后续拟进一步对氟尼缩松和雷替曲塞改善AD模型动物认知能力的作用进行验证，该作用尚无文献报道。

综上所述，本研究基于VGLUT1调控基因集和LINCS药物表达谱数据进行抗AD药物筛选，发现抗AD药物可导致与促进VGLUT1转录相似的表达谱变化，从而发现潜在的抗AD候选药物。该方法既可全面考察药物对细胞作用的整体特征，又可避免细胞基因表达涨落和芯片噪声的影响，是药物重定位研究的理想策略之一。此外，SAMP8为SAD的典型模型，SAD在AD患者中占比＞90%。本研究以SAMP8为模型，对米非司酮抗AD作用进行验证，不仅进一步提示其作为抗AD药物的潜力，同时也为阐明其抗AD作用机制提供了新的探索方向。