lncRNA TMEM161B-AS1通过调控hsa-miR-135b对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖和凋亡的影响

杜 然，王 湘，李希平，崔应东，曾 光

糖尿病肾病是糖尿病患者常见并发症之一，主要表现为肾小管上皮细胞损伤，最终导致肾脏纤维化和肾功能下降[1]。近年糖尿病肾病已成为重要的公共卫生问题，严重影响患者的生存质量[2]。肾小管上皮细胞活力下降和凋亡增加是糖尿病肾小管上皮细胞损伤的关键因素[3]。糖尿病影响肾小管上皮细胞活力和凋亡的确切分子机制并不清楚。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度普遍>200个核苷酸的单链非编码RNA，调控各种底物基因的转录和翻译，参与调控泌尿系统的发育和病理改变[4]。已有研究证实，高糖能够诱导肾小管上皮细胞中lncRNA表达下调或上调，调控lncRNA的表达可有效抑制肾小管上皮细胞的损伤[5-7]。TMEM161B-AS1是一种lncRNA，其基因定位于人染色体5q14.3，长度为409个核苷酸，作为癌基因或抑癌基因参与多种肿瘤的发生发展过程。然而，目前并不清楚TMEM161B-AS1在糖尿病肾小管上皮细胞损伤中的作用。本文探究TMEM161B-AS1在高糖诱导肾小管上皮细胞增殖和凋亡中发挥的作用，并明确其确切分子机制，为探究新的糖尿病肾病防治靶点提供实验基础。

1 材料与方法

1.1细胞与试剂 人肾小管上皮细胞HK-2购于中国科学院细胞库；DMEM培养基、胎牛血清、Lipofectamine 3000试剂盒购于中国赛默飞科技有限公司；细胞凋亡检测试剂盒、qRT-PCR试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；双荧光素酶检测试剂盒、TMEM161B-AS1过表达载体、阴性对照载体购于美国Promega公司；hsa-miR-135b、has-miR-NC、野生型TMEM161B-AS1 WT和突变型TMEM161B-AS1 Mut质粒购于苏州泓迅生物科技有限公司；α-SMA、β-Tubulin、Fibronectin、E-Cadherin、Claudin-1、ZO-1单克隆抗体购于美国Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2细胞高糖培养与分组转染 在水浴锅中快速解冻冻存的HK-2细胞，使用含5%胎牛血清、30 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基，于5% CO2、37 ℃的培养箱内常规培养。将细胞分别接种于12孔板，继续培养12 h，按照Lipofectamine 3000试剂盒说明书，分别将TMEM161B-AS1过表达载体、阴性对照载体转染至HK-2细胞，设为TMEM161B-AS1组和对照组，常规培养36 h后进行后续操作。

1.3qRT-PCR检测TMEM161B-AS1、hsa-miR-135b表达 Trizol法抽提2组细胞总RNA，通过微量分光光度计分析总RNA浓度和纯度，逆转录得到cDNA。qRT-PCR反应程序为96 ℃ 55 s、59 ℃ 27 s、73 ℃ 27 s，进行40个循环。以GAPDH为内参计算TMEM161B-AS1相对表达量，以U6为内参计算hsa-miR-135b相对表达量，引物序列见表1。

表1 TMEM161B-AS1、hsa-miR-135b及其内参的引物序列

1.4CCK-8法检测HK-2细胞增殖 将2组细胞接种于96孔板，每孔6×103个。继续培养1、2、3、4、5 d后，每孔加入25 μl的CCK-8试剂，于培养箱内培养5 h，使用多功能酶标仪在波长460 nm处检测每孔光密度(OD)值，绘制各组细胞生长曲线。

1.5流式细胞术检测HK-2细胞凋亡 收集2组和对照组细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液清洗4次，加入结合缓冲液调整细胞密度为5×105/ml，分别加入PI试剂和FITC-Annexin V工作液各6 μl，在暗室内孵育30 min。加入600 μl结合缓冲液，立即通过流式细胞仪检测HK-2细胞凋亡率。

1.6生物信息学软件预测和双荧光素酶报告基因实验测定 利用在线靶基因预测软件LNCediting预测TMEM161B-AS1的靶基因。按照Lipofectamine 3000试剂盒说明书,分别将hsa-miR-135b、has-miR-NC、TMEM161B-AS1 WT及TMEM161B-AS1 Mut质粒转染至HK-2细胞，转染50 h后，使用双荧光素酶检测试剂盒检测不同细胞相对荧光素酶活性。

1.7Western blot检测HK-2细胞α-SMA、Fibronectin、E-Cadherin、Claudin-1和ZO-1蛋白表达 使用含有苯甲基磺酰氟的裂解液裂解细胞，离心并收集上清，测定蛋白浓度后，每组取60 μg蛋白添加到凝胶孔，进行蛋白电泳。完成蛋白电泳后，进行转膜。采用8%脱脂奶粉去除非特异性结合位点，加入一抗稀释液α-SMA(1∶2000)、β-Tubulin(1∶1000)、Fibronectin(1∶2000)、E-Cadherin(1∶2000)、Claudin-1、ZO-1(1∶2000)，其中β-Tubulin为内参，于4 ℃下孵育8 h。添加特异性二抗稀释液(1∶7000)，室温孵育3 h。配制ECL发光液，均匀滴加在条带上，采用凝胶成像系统曝光蛋白条带。

2 结果

2.1TMEM161B-AS1的二级结构 采用RNA二级结构预测软件UFold预测TMEM161B-AS1的二级结构，见图1。

2.2TMEM161B-AS1过表达载体对高糖诱导HK-2细胞TMEM161B-AS1表达的影响 qRT-PCR检测结果显示，对照组和TMEM161B-AS1组细胞TMEM161B-AS1表达水平分别为0.98±0.12和8.21±1.85。与对照组比较，TMEM161B-AS1组细胞TMEM161B-AS1表达水平明显升高(P<0.01)。

2.3TMEM161B-AS1对高糖诱导HK-2细胞增殖的影响 CCK-8法检测结果显示，与对照组比较，TMEM161B-AS1组细胞培养2～5 d增殖能力显著升高(P<0.05，P<0.01)。见图2。

图2 TMEM161B-AS1对高糖诱导HK-2细胞增殖的影响

2.4TMEM161B-AS1对高糖诱导HK-2细胞凋亡的影响 流式细胞术检测结果显示，对照组和TMEM161B-AS1组细胞凋亡率分别为(12.06±2.46)%和(7.06±0.47)%。与对照组比较，TMEM161B-AS1组细胞凋亡率明显降低(P<0.01)。见图3。

图3 TMEM161B-AS1对高糖诱导HK-2细胞凋亡的影响

2.5生物信息学软件预测TMEM161B-AS1的靶基因 通过在线软件LNCediting预测显示，TMEM161B-AS1与hsa-miR-135b存在互补结合位点。见图4。

图4 LNCediting软件预测TMEM161B-AS1的靶基因

2.6TMEM161B-AS1与hsa-miR-135b的关系 双荧光素酶报告基因实验结果显示，与转染has-miR-NC比较，转染hsa-miR-135b能显著降低HK-2细胞TMEM161B-AS1 WT的荧光素酶活性(P<0.01)，二者对于TMEM161B-AS1 Mut荧光素酶活性无明显影响(P>0.05)。提示hsa-miR-135b能抑制HK-2细胞TMEM161B-AS1 WT荧光素酶活性，但不能降低TMEM161B-AS1 Mut荧光素酶活性。见图5。

图5 双荧光素酶报告基因实验验证TMEM161B-AS1与hsa-miR-135b的关系

2.7TMEM161B-AS1对hsa-miR-135b表达的影响 qRT-PCR检测结果显示，对照组和TMEM161B-AS1组细胞hsa-miR-135b表达水平分别为5.37±0.99和1.06±0.51。与对照组比较，TMEM161B-AS1组细胞hsa-miR-135b表达水平明显降低(P<0.01)。

2.8TMEM161B-AS1对高糖诱导HK-2细胞上皮-间质转化表型蛋白的影响 Western blot检测结果显示，与对照组比较，TMEM161B-AS1组上皮细胞表型蛋白ZO-1、E-Cadherin、Claudin-1表达明显增加，间质细胞表型蛋白α-SMA、Fibronectin表达明显降低(P<0.05)。见图6。

图6 Western blot检测TMEM161B-AS1对HK-2细胞上皮-间质表型蛋白的影响

3 讨论

糖尿病肾病是一种糖尿病微血管并发症，最终导致终末期肾病[8]。高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤涉及多种分子信号通路的异常改变[9]。lncRNA是一种表观遗传修饰因子，通过改变染色质结构、调节基因转录水平和转录后修饰，影响细胞的生理和病理行为[10-11]。近年来，lncRNA已成为糖尿病肾病研究的热点。有研究表明，lncRNA Dlx6os1在糖尿病肾病小鼠肾脏组织中高表达，敲低lncRNA Dlx6os1表达能够抑制高糖诱导肾小球系膜细胞增殖、纤维化和炎性细胞因子释放[12]。lncRNA PAX8-AS1-N在糖尿病肾病患者血液和尿液中低表达，能通过直接靶标miR-17-5p增强小鼠足细胞的增殖能力并降低细胞的凋亡比例[13]。lncRNA lnc-ISG20在糖尿病肾病小鼠肾组织中表达升高，沉默lncRNA lnc-ISG20表达能够减轻高糖诱导的肾脏纤维化，可能成为糖尿病肾病的诊断指标[14]。

TMEM161B-AS1是一个功能性lncRNA。SHI等[15]研究结果显示，TMEM161B-AS1在食管鳞状细胞癌组织中表达低于正常组织样本，其低表达与食管鳞状细胞癌患者TNM分期、淋巴结转移和预后不良有关，过表达TMEM161B-AS1能抑制食管鳞状细胞癌细胞的葡萄糖消耗和乳酸产生。CHEN等[16]研究显示，TMEM161B-AS1能够上调多个铁死亡相关基因的表达，从而促进胶质细胞瘤的恶性生物学行为及对替莫唑胺的耐药性。TMEM161B-AS1在肾小管上皮细胞中的功能尚不明确。

本研究显示，上调TMEM161B-AS1能够促进HK-2细胞的增殖，抑制HK-2细胞的凋亡。提示TMEM161B-AS1可能在高糖诱导肾小管上皮细胞中发挥保护作用，从而抑制糖尿病肾病的进展。既往研究证实，miRNA是一种高度保守的不具有编码功能的转录本，lncRNA能够靶向结合特定miRNA，覆盖其功能区域，从而调节细胞的各种生命活动[17-19]。本研究显示，TMEM161B-AS1与hsa-miR-135b存在结合位点。双荧光素酶报告基因实验证实TMEM161B-AS1与hsa-miR-135b序列间直接结合。本研究还显示，HK-2细胞TMEM161B-AS1表达升高后，hsa-miR-135b表达被抑制。以上结果表明HK-2细胞存在TMEM161B-AS1/hsa-miR-135b信号调控通路。已有研究表明，在高糖刺激的肾小管上皮细胞中hsa-miR-135b表达显著上调，hsa-miR-135b参与高糖诱导的氧化应激过程，抑制肾小管上皮细胞的增殖并促进其凋亡[20]。肾小管上皮细胞损伤能够诱发上皮-间质转化，是最终发展至肾纤维化的重要环节[19]。本研究结果显示，TMEM161B-AS1表达上调后，高糖诱导HK-2细胞的上皮细胞表型蛋白ZO-1、E-Cadherin、Claudin-1表达明显增加，间质细胞表型蛋白α-SMA、Fibronectin表达明显降低，表明TMEM161B-AS1能够抑制HK-2细胞的上皮-间质转化，

综上所述，lncRNA TMEM161B-AS1通过抑制hsa-miR-135b表达，促进高糖诱导HK-2细胞增殖、抑制其凋亡及上皮-间质转化,从而参与肾小管上皮细胞的功能活动，通过调控相关通路促进肾小管上皮细胞的增殖并抑制其凋亡。