基于羊肚菌交配型检测的半地下式暖棚减产原因分析

夏伟伟 高春燕 李 慧 贾保太 王朝江*

（1河北省农林科学院经济作物研究所，河北石家庄 050051；河北省宁晋县农业农村局，河北邢台 055550）

羊肚菌栽培简单粗放、效益高，是近几年栽培面积急剧增加的食用菌之一。羊肚菌鲜菇上市越早价格越高，因此，北方掀起了暖棚栽培羊肚菌潮。半地下式暖棚相比平地式暖棚，具有更好保温保湿的特点，成为栽培羊肚菌的理想场所。因此，有蔬菜大棚直接转产或被租赁转产羊肚菌。但有众多大棚的栽培效果不理想，产量低，甚至绝收，且原因并非重茬引起的。

栽培羊肚菌需要购买大量栽培种、营养袋，每667 m2投入7 000~8 000 元，且初次栽培还需高薪聘请技术指导专家，所以一旦栽培失败，就会损失惨重。许多栽培户和研究人员将减产绝收的原因归咎于菌种老化、污染，营养袋灭菌不彻底，原基形成期的环境不稳定等[1−2]。是否仅是上述原因造成减产绝收还有待商榷，如出菇环境调控因素，半地下暖棚的温度逆境是可以调控的，在浇催菇水时基本不出菇，也不是大水逆境造成；杂菌因素，在笔者团队指导的栽培户，已具有识别菌种是否被污染的能力；灭菌因素，制备营养袋时，一般能控制好麦粒含水量，经高压灭菌，杂菌已被彻底杀灭。因此，半地下式暖棚出现的低产、绝产的原因需要从其他方面深入细致地分析，以进一步为羊肚菌产业的持续发展提供技术支持。笔者针对当地合作社出现半地下式暖棚减产问题进行调研，并从菌丝存活状态角度查找原因，现总结如下，供广大栽培户和同行参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

用打孔器取4 个减产代表棚的菇体处、菇体外围5 cm处、覆膜处有菌丝和无菌丝的2~5 cm深处土样。取样前刮去表层土2 cm，以排除菌霜DNA 干扰。每处取3个样，3个取样位点大体呈三角形。

羊肚菌交配型引物[3]由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。仪器为T100−PCR 仪，美国Bio−Rad 公司。

表1 羊肚菌交配型引物序列

1.2 试验方法

1.2.1 减产的半地下式暖棚栽培管理情况调查

调查减产半地下式暖棚的栽培地点，所用棚结构、规格，土壤质地与播前处理以及栽培时间、品种、播种量、播种方式、发菌与催蕾等过程管理细节。

1.2.2 减产的半地下式暖棚出菇情况调查

调查包括出菇多寡、出菇位置、地表菌丝状态和营养袋基质颜色变化等情况，而后归纳分析，并确定各型代表性棚为后续研究对象。

1.2.3 减产的代表棚羊肚菌菌丝存活状态检测

羊肚菌菌丝存活状态指土层中菌丝有无、两个交配型是否齐全，可通过羊肚菌交配型引物以土层中DNA 为模板的扩增产物电泳条带测得，借以判断土层中羊肚菌菌丝是否具备出菇能力。

土样取回后压烂，拌匀过筛（孔径为0.85 mm），其中部分用于烘干法（55 ℃，24 h）测含水量（土样中水/土样湿重×100），部分用于CTAB法提取DNA。

提取DNA 以10 mL 离心管为容器，提取前预测得其最大湿土容量为3 g，2%CTAB 裂解液最大加量为2 000µL，1%CTAB 沉淀液最大加量为7 200µL，利用最大的样品量获取DNA，以排除因土样量少造成的提取失败干扰。

交配型扩增反应体系25µL，其中土样DNA 2µL，上下游引物各1µL，2×ES Mix12.5µL，ddH2O 8.5 µL；扩增程序：94 ℃ 3 min，（94 ℃ 1 min，50 ℃30 s，72 ℃ 1 min）×32，72 ℃ 5 min[3]。

1.2.4 平地式暖棚的出菇情况调查

为准确找出半地下式暖棚减产原因，在宁晋县尧台村，选择与其具有相同菌种来源、播种时间、播种量以及管理措施的同背景平地暖棚栽培区，进行对比调查。

2 结果与分析

2.1 减产的半地下式暖棚栽培管理调查结果

合作社栽培羊肚菌园区位于石家庄市鹿泉区李村，有80座半地下式暖棚，棚墙体三面土垒，棚底下沉0.6 m，棚长90 m，宽8 m，棚顶及棚阳面有膜搭茬通风孔隙，土壤为壤土。播种前15 d，每667 m2撒石灰100 kg，用小型旋耕机翻耕。播种前2 d栽培地浇透水，水下渗后播种。栽培品种为六妹系列G8，用种量为225 kg/667 m2，播种前将菌种揉碎至直径0.5~1.0 cm颗粒。

2021 年 11 月 26 日播种，当时土壤温度为 9 ℃，棚内温度为7 ℃。播种方式采用平地按畦沟播，畦面宽1 m，畦间留0.3 m 走道。播种时将菌种均匀撒在开好的条状沟内，然后整平，覆土3~5 cm。播种后畦面覆盖扎有透气孔的黑色塑料薄膜，膜宽同畦面。播种后3 d，土壤表面可见稀疏的菌丝，7 d菌丝量增多，10 d 后摆放外源营养袋，掀开塑料薄膜，放入营养袋后再盖好薄膜。营养袋用量为2 200袋/667 m2，单袋湿重1 kg。

发菌期间温度一直稳定在3~10 ℃，不喷水，覆膜避光培养菌丝。2 月25 日菌霜开始消退，菌丝变黄，畦面上已有少量原基形成，此时开始催蕾管理。方法是揭开塑料膜，晾3 d，然后大水漫灌整个畦面。同时温度管理为中午棚外温度高时，卷起覆盖物提高棚温；温度低时，撑开通风口薄膜降温，以拉大棚内温差，如此刺激3~5 d，同时给以散射光照射。7~10 d 后，有些棚有原基出现，但在膜间走道原基多，畦面上少；有些棚20 d 后仍未现蕾。调查发现在浇催菇水前各棚土层表面均有大量菌霜，浇水后则全部消退，其间一直保持棚内温度为6~14 ℃，土壤温度8~12 ℃，空气相对湿度85%~90%，均适合原基发生及子实体生长。

2.2 减产的半地下式暖棚出菇情况

现场调查多个菇棚后，发现所谓出菇多的棚内也出菇不多；地表菌霜消退，说明催菇水有清退菌霜的作用；营养袋基质变黑塌瘪，说明基质持续处于高水分环境中，在细菌作用下腐败变质。根据出菇量和地表有无菌丝可将减产菇棚分为4 种类型（图1）。

多菇棚（图1a）。此棚特点是出菇多的位置在薄膜搭茬的间隙走道区，顺走道远观似一条菇带，而覆膜处散生菇稀疏。覆膜下和膜间隙地面都有菌丝冒出土层，后者也比前者多，且成片或有菌霜，发白呈带状。但因浇催菇水前的菌霜已消失，此应为二次菌霜。

少菇棚（图1c）。该棚出菇情况同多菇棚，差别是膜间隙区域的菇更少。

无菇有菌丝棚（图1b）。此棚薄膜覆盖面和膜间隙处都无菇，但覆膜处有散片状分布的菌丝，膜间隙处能看到条带状发白的菌丝或菌霜。

无菇无菌丝棚（图1d）。该棚情形和无菇有菌丝棚相近，不同之处是在覆膜处连散片状的菌丝也没有，膜间隙处有菌丝或显菌霜。

图1 4种减产的半地下式暖棚

另外，无菇有菌丝棚在催菇前是有原基或幼菇的，浇水后不再出菇，表明催菇时，浇水对菇体有损害。多菇棚、少菇棚出菇部位本应在覆膜处畦面，但出菇量比膜间隙区还稀疏，表明覆盖薄膜明显抑制出菇。覆膜的畦面与膜间隙处的差别，主要是后者透气性好，故推测覆膜伤害丝，使菌丝活力下降，不但影响出菇，且对催菇水造成的逆境抵抗力变弱（表2）。

2.3 减产的半地下式暖棚羊肚菌菌丝存活状态

烘干法测得菌丝含水量为16.5%~16.8%，虽偏低，但取样时却极易捏成团块。

羊肚菌两个交配型引物扩增的7 个位点，共21个重复的土样（土样来源编号如表2）中菌丝DNA产物电泳条带见图2，图2 中上半部为Ⅰ型产物，下半部为Ⅱ型产物，同一土样的Ⅰ、Ⅱ交配型产物电泳图上下对应。

图2 土样DNA两个交配型扩增产物电泳图

表2 减产的半地下式暖棚出菇表现

由图2可以看出，2个交配型在同一土样中被检出，或1个交配型被检出的机会随着出菇变少、菌丝消失而明显降低；任一交配型未检出的机会，在各种出菇状态下都存在，催菇水前后无菇也无菌丝的检出机会最高，与各棚出菇多少和不出菇的表现基本吻合。说明出菇的土层中羊肚菌菌丝并不密，且出菇边土层菌丝又比出菇处土层少；菌丝分布在浅层土；栽培期间羊肚菌菌丝存在减少消亡现象。

2.4 平地式暖棚出菇情况

该类棚出菇整体良好，菇密集区位于覆膜下，未出现成片无菇区，覆膜间隙的菇大部分在覆膜的边缘，呈明显的菇垄状，间隙区菇少呈空心状态（图3）。结合减产半地下式暖棚多菇处2 个交配型菌丝检出机会多的结果，表明正常高产菇棚，覆膜下才是出菇多和菌丝密集的地方；营养袋基质多呈白色，表明覆膜期间细菌腐败程度低。

图3 平地式暖棚羊肚菌出菇

两种暖棚的出菇现状表明，同等情况下，仅棚底是否下沉结构差别就可带来不同的栽培羊肚菌效果。

3 小结与讨论

3.1 羊肚菌菌丝存活状态制约其产量

出菇不稳定是羊肚菌生产的最大问题和难点，两个交配型基因同时存在，才能实现子实体正常发育和产生子囊孢子[3]，并引导研究者将解决不出菇问题的侧重点放在菌种的交配型检测上[4]。研究则进一步证明，即使在相同菌种的遗传背景下，土层中羊肚菌菌丝仍存在着数量减少、交配型丢失等存活状态变化，从而导致减产、绝产等后果。

3.2 覆膜等常规管理影响羊肚菌菌丝存活状态

首先从菌丝由多变少和转向间隙区出菇的成因分析，相对于膜间隙区覆膜下部是羊肚菌菌种和营养袋密集处。半地下式暖棚的覆膜下出菇却少于间隙区，而两区在覆膜前的菌丝表观状态基本相同，据此推测覆膜改变了菌丝存活状态。对于土壤水分高且易保持的半地下暖棚来说，长时间覆膜（即使膜上有透气孔）因水的反复蒸发和凝结滴落终究会造成表层土湿度高、缺氧。羊肚菌是好氧菌，且菌丝主要分布在浅层土，长时间缺氧必然导致其生长乏力或死亡。

分析浇催菇水前有菇而后不出菇的成因可知，覆膜下菌丝数量、存活状态与覆膜造成的缺氧状态相关，存在高湿度下菌丝变少、活力变弱的情形，此时再遇大水（催菇水），缺氧加重，菌丝进一步弱化，最后导致水后无菇。

由此可见，覆膜虽可促进羊肚菌菌丝萌发，保持土壤墒情，提高菌丝活力，但因半地下式暖棚棚底含水量高，湿度过高阻断氧气供给，从而抑制菌丝活力，最后导致减产或绝收。因此，覆膜有利弊，切忌机械照搬。把握好覆膜时间，在覆膜后根据墒情适当透气。