鸡腿菇菌种不同保藏方法比较试验

阳新春 杨财容 祁伟亮 陈 佳 刘松青

（成都师范学院化学与生命科学学院，四川成都 611130）

鸡腿菇Coprinus comatus是一种食药两用菌，口感细嫩，风味独特，具有增强机体免疫力、降血糖血压、改善心率、抑制肿瘤、防癌及抗癌等功效[1−3]。近几年来，栽培鸡腿菇也是助力巩固脱贫成果的主要举措之一，鸡腿菇生产发展较快。菌种是食用菌生产和研究的重要材料，而菌种在繁育过程中极易发生变异[4−6]，科学、高效地保藏好菌种是高产的前提，所以菌种保藏越来越被重视[7−9]。鸡腿菇菌种保藏方法众多，各具优缺点，但目前国内外学者针对羊肚菌、香菇、草菇、真姬菇等菌种的最适保藏方法做了较多研究，而对于鸡腿菇的菌种保藏方法研究相对缺少[10−12]。因此，笔者比较几种常见的鸡腿菇菌种保藏方法的保藏效果，以期找出相对便捷、价廉、高效的鸡腿菇菌种保藏方法，为鸡腿菇菌种保藏提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料及试剂

供试菌株为鸡腿菇特大9201，购于京山市成林菌业店。PDA 培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15~20 g，蒸馏水1 000 mL。主要试剂：液体石蜡油 、NaCl 溶 液 、琼 脂 、PEG6000、PEG10000、PEG20000、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO），均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化

将供试鸡腿菇菌株接入PDA 斜面培养基中活化。当菌丝长满试管后，将其转移到含有PDA 直径为9 cm 的培养皿中，于25 ℃培养，菌落长至培养皿一半后，取部分菌丝作为原始菌种，检测菌丝生长速度、脱氢酶活性，部分作为初始菌种，供保藏试验。在无菌环境下，将菌种分成0.9 cm块备用。

1.2.2 保藏试验

1.2.2.1 斜面低温保藏

PDA 培养基灭菌（121 ℃，30 min）后，装入试管摆斜面后放入25 ℃培养箱，24 h 检查无菌后备用。将1.2.1 菌块接于斜面试管内，并于25 ℃的培养箱中培养，重复3 次。培养5 d 后，观察菌落形态等基本特征，判断是否被杂菌污染以及该培养物是否与原菌种一致。检查确认无误后，置于4 ℃冰箱中保藏60 d。

1.2.2.2 液体石蜡油保藏

液体石蜡油（石蜡油）灭菌（121 ℃，30 min）后取出放在60 ℃干燥箱中烘干水分，直至石蜡油澄清备用。取1.2.1 菌种块3~4 块于5 mL 灭菌冻存管（实验室保存菌种专用）中，再加入3~4 mL 石蜡油后置于室温保存60 d。重复3次。

1.2.2.3 水溶液保藏

水溶液保藏采用无菌水、NaCl 溶液、聚乙二醇溶液保藏。参考朱华玲等[13]保藏方法，设置NaCl 溶液的体积分数梯度为0.3%，0.6%，0.9%，1.2%；设置体积分数为0.1%的聚乙二醇溶液的分子量分别为PEG6000，PEG10000，PEG20000。取 1.2.1 菌种 3~4块于5 mL 灭菌冻存管中，再分别加入3~4 mL 无菌水、NaCl 溶液和聚乙二醇溶液后放入4 ℃冰箱保藏60 d。每个处理重复3次。

1.3 菌丝保藏效果考察

1.3.1 菌丝生长速度测定

斜面低温保藏与水溶液保藏均需在保藏60 d后取出试管，于25 ℃下复活培养3 d；液体石蜡保藏60 d 后取出试管，转接菌块于PDA 平皿上培养3 d。之后各自取9 mm 菌块于PDA 平皿上，培养7 d 后测量菌落直径，并计算菌丝平均生长速度。

式中，菌落直径D1为0.9 cm。

1.3.2 菌丝脱氢酶活性测定

脱氢酶活性可以反映微生物对有机物的代谢能力，从而反映菌丝活力。鸡腿菇菌丝脱氢酶活性的测定按照熊川等[14]方法，用分光光度计于490 nm波长处测量吸光值OD，二甲基亚砜（DMSO）作空白对照。OD 值越大，则酶活性越高，菌株保藏效果越好。

1.4 数据分析

用SPSS 25.0软件对菌丝平均生长速度、脱氢酶活性进行多重比较及差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 三类保藏方法保藏效果

由表1 和图1 可知，不同保藏方法保藏后的鸡腿菇菌丝的生长速度（平均生长速度，下同）、脱氢酶活性以及菌落形态有差异。与鸡腿菇原始种相比，聚乙二醇溶液保藏的鸡腿菇菌种菌丝生长速度加快，其他保藏方法的鸡腿菇菌种菌丝生长速度均下降；采用0.6%、0.9%、1.2% NaCl 溶液及斜面保藏的鸡腿菇菌种菌丝脱氢酶活性下降，其他保藏方法的脱氢酶活性均上升。

图1 试验保藏方法的保藏效果菌种对比

表1 各种保藏方法的保藏鸡腿菇菌种效果

考察保藏后的鸡腿菇菌种菌丝生长各个指标参数发现，大部分水溶液保藏的鸡腿菇菌种菌丝生长各指标均较好。菌丝生长速度，大多数的水溶液保藏法>斜面低温保藏法>石蜡油保藏法；斜面低温保藏法的菌丝生长速度与无菌水、1.2%NaCl 保藏法无显著差异，但显著低于0.1% PEG10000、0.1%PEG20000、0.1% PEG6000、0.9% NaCl 保藏法；而石蜡油保藏法保藏后的菌种菌丝生长速度仅与0.6%NaCl 保藏法无显著差异，显著低于其他7 种水溶液保藏法保藏的菌种。

鸡腿菇菌种菌丝脱氢酶活性，大多数的水溶液保藏法>石蜡油保藏法>斜面低温保藏法，斜面低温保藏法的菌丝脱氢酶活性与0.6%NaCl、0.9%NaCl、1.2% NaCl 保藏法无显著差异，但显著低于0.1%PEG20000、0.1%PEG10000、无菌水、0.1%PEG6000、0.3% NaCl 水溶液保藏法；石蜡油保藏法仅与0.3%NaCl、0.1% PEG6000 水溶液保藏法无显著差异，但显著低于无菌水、0.1% PEG10000、0.1% PEG20000水溶液保藏法。斜面低温保藏的菌种菌丝生长速度高于石蜡油保藏法，但石蜡油保藏的菌种菌丝脱氢酶活性却高于斜面低温保藏法，甚至高于原始种。

鸡腿菇菌种菌丝长势，大多数的水溶液保藏法>斜面低温保藏法>石蜡油保藏法。鸡腿菇菌种综合菌丝生长速度、脱氢酶活性、长势，三大类保藏方法的保藏效果为大多数的水溶液保藏法优于斜面低温保藏法，石蜡油保藏法。

2.2 水溶液保藏法保藏效果

由图2 可知，不同水溶液保藏方法对鸡腿菇菌种的保藏效果不同。不同水溶液保藏后鸡腿菇菌种菌丝生长速度次序：聚乙二醇溶液>0.9%NaCl 溶液>1.2% NaCl 溶液>无菌水>0.3%NaCl 溶液>0.6%NaCl溶液；菌丝脱氢酶活性次序：0.1%PEG20000溶液>0.1%PEG10000 溶液>无菌水>0.1%PEG6000 溶液>NaCl溶液。

图2 水溶液处理组对鸡腿菇菌种保藏效果对比

由表1可知，无菌水、NaCl溶液保藏的鸡腿菇菌种菌丝生长速度均显著慢于0.1%PEG10000、0.1%PEG20000 保藏法，但无菌水保藏的菌丝脱氢酶活性则与0.1%PEG10000、0.1%PEG20000 无显著差异，因此无菌水保藏效果比NaCl溶液组保藏效果要好。

综上，聚乙二醇溶液的保藏效果最好，其次是无菌水，NaCl溶液保藏效果最差。

NaCl 溶液处理组中，保藏效果最好的是0.9%NaCl 溶液；不同分子量的0.1%聚乙二醇溶液处理组，0.1% PEG20000 的保藏效果最好。比较无菌水、0.9% NaCl 溶液、0.1% PEG20000 溶液这三种保藏法的效果可知（图3）：保藏效果依次为0.1%PEG20000，无菌水，0.9%NaCl。

图3 不同水溶液中保藏效果最好对比

2.3 水溶液最优保藏法（0.1%PEG20000）与斜面低温、石蜡油保藏法效果比较

由图4可知，0.1%PEG20000保藏的菌种菌丝生长速度、脱氢酶活性均高于原始种；石蜡油保藏的菌种菌丝生长速度与原始种相比明显慢，但脱氢酶活性高；斜面低温保藏的菌种菌丝生长速度和脱氢酶活性均较原始种低。由表1可知，0.1%PEG20000保藏的鸡腿菇菌种菌丝长势最旺盛，而石蜡油保藏两个月之后的菌种接种到培养基后，培养过程中极易长出霉菌且菌丝生长缓慢，这是菌种退化的表现。由此可见，就短期保藏效果，0.1%PEG20000保藏法优于斜面低温保藏法、石蜡油保藏法。

图4 水溶液最优保藏法（0.1%PEG20000）与其他两大类保藏效果比较

3 小结

试验结果表明，三大类保藏方法中保藏效果最好的是水溶液保藏法，其中保藏效果最佳的是0.1%PEG20000 水溶液，其次是斜面低温保藏法，保藏效果最差的是石蜡油保藏法。聚乙二醇溶液保藏效果最好，这可能是因为聚乙二醇溶液对菌丝细胞具有保护作用[13]。石蜡油保藏效果差可能因菌丝上携带少量石蜡油抑制其生长，不适合短期保藏。

研究筛选出最适鸡腿菇菌种短期保藏的方法，可为鸡腿菇菌种提供成本廉价、经济高效、操作简便的短期保藏方法参考。