microRNA在糖尿病肾病中的作用机制与研究进展

邹梦林，罗来敏，张桂玲，鄢 艳

(南昌大学 a.第一附属医院高新医院肾内科,南昌 330096； b.第一附属医院肾内科，南昌 330006)

microRNA(miRNA)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长20～25个核苷酸。通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译，从而抑制其靶基因的表达，参与机体各种生理与病理过程的调节，对机体免疫反应及疾病的发生发展与转归起重要的调控作用，包括糖尿病肾病(DN)[1-2]。DN是糖尿病最常见最严重的慢性微血管并发症之一，在西方国家已成为导致终末期肾病的主要原因[3]，有文献[4]报道,在我国住院患者中，糖尿病肾病超肾小球肾炎是导致慢性肾脏病的首要原因。李洁等[5]对miR-192介导的β信号通路进行研究，结果显示miRNA调控作用可能成为DN一个新的诊断标志及治疗靶点。此后，miRNA在DN发病机制中的作用日益受到关注。有研究[6]发现，miRNA对肾小球基底膜和系膜细胞的损伤、足细胞的损伤及肾小管间质纤维化的调控起到了关键作用。本文就miRNA在DN中的作用机制及研究进展作一综述。

1 miRNA的特点及功能

miRNA广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，本身不具有开放阅读框架(open reading frame,ORF)；成熟的miRNA 5′端有一磷酸基团，3′端为羟基,3′端可以有1～2个碱基的长度变化，这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段区别开来；多数miRNA还具有高度保守性、时序性和组织特异性。1993年LEE等[7]在秀丽新小杆线虫中首次发现miRNA，它在不同生物体的发育、分化、细胞增殖和凋亡途径中发挥着重要的调节作用。目前已知的抑制靶基因表达有两种方式：1)与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻译水平上抑制其表达(哺乳动物中比较普遍)，有可能影响mRNA的稳定性；2)与靶mRNA互补，这些miRNA的结合往往引起靶mRNA的降解(在植物中比较常见)[8]。这些结合位点通常都在mRNA的编码区或开放阅读框中。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。随着miRNA调控基因表达研究的逐步深入，miRNA作为疾病的诊断标志及治疗靶点的潜在价值也受到人们的日益关注。

2 miRNA参与DN的机制

有研究[9]证实，长期高血糖刺激会导致肾小球肥大、炎症细胞浸润、基底膜增厚、肾小球硬化和肾小管萎缩，最终导致肾衰竭。在早期的一项研究中，SUN等[10]通过生信分析及蛋白质印迹法，发现5种miRNA(miR-192、miR-194、miR-204、miR-215和miR-216a)在人体肾脏中较其他器官中高表达，表明它们在肾脏疾病发生发展中有着潜在作用。随着基因芯片、生信分析、高通量测序等技术的进展，表明miRNA表观遗传调节、转录后调节在DN发病相关机制中起重要作用[11]。

2.1 参与肾小球基底膜和系膜细胞的损伤

糖尿病肾病主要病理学特点有基底膜增厚、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)积聚、系膜扩张、肾小管间质纤维化、足细胞足突融合及消失等[12]。转化生长因子β(transforming growth factor-beta1,TGF-β)在糖尿病肾病肾小球系膜细胞肥大和纤维化过程中起重要作用。Smad蛋白家族是最早被证实为TGF-β信号转导的下游蛋白，它存在细胞质中，可将信号由细胞膜传至细胞核中。Smad蛋白根据功能不同分为受体激活型(receptor-regulated Smads，R-Smads)、通用介导型(common-partner Smads，Co-Smads)及抑制型(inhibitory Smads，I-Smads)三大类。Smad2与Smad3均属受体激活型蛋白，它们被TGF-β的Ⅰ型受体磷酸化后可与Smad4形成异源性三聚体复合物，并转入核内与DNA结合激活DNA转录，调节靶蛋白的表达[13]。ZHONG等[14]发现，20周龄2型糖尿病模型db/db小鼠肾小球系膜细胞miR-21表达比同龄小鼠增加了1倍，同时，检测到其靶基因磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue,PTEN)、Smad7表达减少，TGF-β1、Smad3和NF-κB 水平升高并伴有系膜细胞纤维化和肥大。然而，通过基因敲除或予以反miR-21寡核苷酸后PTEN及Smad7表达增加，TGF-β1、Smad3和NF-κB水平均下降，提示miR-21可能通过抑制PTEN及Smad7表达激活TGF-β/Smad3和NF-κB信号通路进而导致肾小球系膜细胞增殖、纤维化。这与MCCLELLAND等[15]研究一致。

DESHPANDE等[16]研究发现，miR-192在链脲菌素(streptozocin,STZ)诱导的1型和2型糖尿病小鼠肾小球中的表达均高于对照组，且TGF-β或高糖(high glucose,HG)刺激也能增加miR-192在小鼠系膜细胞(mouse mesangial cells，MMC)和人MC中的表达。有文献[17]报道，miR-192通过抑制锌指E盒结合蛋白1(zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)及锌指E盒结合蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)的表达，继而导致下游Ⅰ型胶原蛋白α2(type 1 collagen α2，Col1α2)和Ⅳ型胶原蛋白α1(type 4 collagen α1，Col4α1)沉积。KATO等[6]还证实miR-192通过抑制ZEB1和ZEB2的表达，增加肾小球系膜细胞中其他miRNA的表达，例如miR-216a、miR-217和 miR-200b/c增加产生放大电路，进一步促进胶原蛋白的沉积。DESHPANDE等[18]发现与野生型小鼠相比，miR-192基因敲除小鼠和miR-192抑制剂治疗的小鼠肾小球肥大、纤维化都较轻。有报道[19]显示，抗癌药物小剂量紫杉醇，通过下调miR-192，可以预防残肾模型的肾纤维化。另，在肾缺血再灌注模型中，使用基因敲除手段，发现小鼠miR-192水平较低，而miR-192水平较低的小鼠存活率较高[20]。表明抑制miR-192的水平对治疗肾脏疾病是有益的，这也为治疗DN提供新的方向。KATO等[21]研究发现，经TGF-β诱导的小鼠系膜细胞中miR-216a和miR-217表达上调，它们都是通过抑制靶向基因PTEN的表达来激活PI3K/AKT信号通路，导致系膜细胞肥大、增生。miR-200家族成员根据基因组结构被分成miR-200a、miR-200b和miR-200c。它们位于非编码RNA的内含子中，当E-box上调时，可增加miR-200家族的表达；miR-200家族通过作用于Fog2来激活PI3K信号通路，导致肾细胞肥大和纤维化[22]。

2.2 参与肾小球足细胞损伤

在DN早期，会出现足细胞足突融合等改变。随着DN的进展，足细胞会凋亡与脱落，导致大量蛋白尿，而蛋白尿的出现可进一步加重足细胞的损伤，由此形成恶性循环，最终导致终末期肾脏病。ZHDANOVA等[23]选择性敲除小鼠Dicer基因(调控足细胞miRNA生成的关键基因)，小鼠出现大量蛋白尿、病理变化，足细胞凋亡、肾小球硬化等。这提示miRNA对维持足细胞正常功能至关重要。有研究[24]表明，miR-29c在DN患者足细胞中升高，足细胞中过表达miR-29c可导致炎症细胞因子，如IL-1、IL-6、IL-18、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的升高。然而，用其抑制剂抑制miRNA-29c表达可以降低足细胞中的炎症细胞因子。这表明miRNA-29c可能通过增加炎症因子的表达参与DN的发生发展。LONG等[25]实验发现，在2型糖尿病db/db小鼠肾小球、HG处理的小鼠内皮细胞和足细胞中，miR-29c均出现上调，且miR-29c通过靶向抑制Spry1表达，激活Rho激酶，参与DN患者ECM沉积和足细胞凋亡，予以反义寡核苷酸沉默miR-29c基因后，可抑制DN患者肾脏内皮细胞和足细胞凋亡，减少患者蛋白尿和ECM沉积。LEE等[26]发现，miR-146a在糖尿病肾病患者足细胞中表达明显减少，miR-146a水平较低的患者与对照组相比，肾功能明显下降得更快；该作者还发现，miR-146a表达下降，直接导致其靶基因Notch-1和ErbB4的表达上调。正常情况下，miR-146a可以抑制ErbB4信号传导，而DN患者可以通过TGF-β1信号通路降低miR-146a表达，从而激活ErbB4信号转导。使用ErbB4受体阻滞剂厄洛替尼治疗后，DN患者蛋白尿进展缓慢，肾小球损伤较前减轻。此外，WAN等[27]研究表明，miR-146a表达的增加可以抑制DN患者的炎症反应和氧化应激。

2.3 参与肾小管间质纤维化

肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)是评估肾功能衰竭严重程度的重要指标，因此阐明TIF在DN中的发病机制具有重要意义。有研究[28]表明，miR-34a-5p可以通过靶向调节沉默信息调节因子2相关酶1(sirtuin-1，SIRT1)，导致DN患者肾小管间质纤维化。有研究[29]显示，在DN小鼠肾组织中，miR-34a-5p水平上调，导致其下游分子SIRT1表达下降，然而，SIRT1低表达可导致TGF-β1表达明显增加。这提示miR-34a-5p/SIRT1可能通过TGF-β1信号通路加重DN的TIF进展。除TIF外，miR-34a-5p还可以通过抑制BCL-2和BCL-W(BCL家族抗凋亡成员)蛋白的产生，增加硬脂酸诱导的胰岛β细胞脂质毒性[30]。因此，减少miR-34a-5p表达可能是防治TIF和胰岛β细胞脂毒性的有效策略。另外，在研究糖尿病大鼠的miRNA表达谱时，ZANCHI等[31]发现，miR-184在晚期DN大鼠肾脏中的表达显著上调，并且主要集中在受损的近端小管区域，同时出现脂肪磷酸酶3(llipophosphatase 3，LPP3)的表达减少和间质3型胶原的增多。巧合的是，他们还发现大鼠肾脏连续切片中LPP3染色减少，既往研究[32]证实，LPP3的减少会增加溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)的表达，进一步导致肾小管间质纤维化。

一些miRNA，包括miR-192，在严重或晚期DN模型中被下调，如糖尿病Apoe基因缺陷小鼠[33]。DN晚期肾小管坏死/凋亡，可导致肾小管上皮细胞miRNA水平降低。WANG等[33]观察到，在HG或TGF-β1处理下，小鼠近端肾小管上皮细胞中miR-192表达下降，同时检测到E-钙黏素(E-cadherin)降低。E-cadherin是一种钙依赖性的跨膜蛋白，参与细胞与细胞间黏附，它广泛分布于人和动物的各类上皮细胞，其中包括肾小管上皮细胞，在维持细胞的极性和完整性等方面起着重要作用。当E-cadherin减少时，可出现肾小管上皮细胞损伤、肾间质纤维化。

3 miRNA可作为DN的分子标志物和治疗靶点

随着miRNA检测和定量技术的迅速发展，包括基因芯片、定量PCR和高通量测序，开发miRNA作为人类疾病的潜在生物标记物和治疗靶点成为研究热点。miRNA在人体血浆及尿液中稳定存在，血液中存在的miRNA是癌症、组织损伤和心力衰竭的敏感生物标志物[34-35]。TAYEL等研究[36]发现，与健康对照组相比，DN患者中的miR-126和miR-192表达下调，进一步分析发现，miR-126和miR-192表达与肌酐水平及尿白蛋白肌酐比值(ACR)呈负相关。此外，MENG等[37]研究表明，尿液中miR-199-3p的降低可以从糖尿病患者和健康对照中筛查出DN患者。故除了miR-192，其他关键性的miRNA如miR-21、miR-200家族成员及miR-29b/c的靶向抑制或过表达，在DN和其他肾脏疾病的体外和体内模型中显示出一定的应用前景。

KÖLLING等[38]研究认为，在DN小鼠肾脏中，miR-21是表达较多的miRNA之一，体内外抑制这种miRNA可以降低系膜基质扩张、间质纤维化、巨噬细胞浸润、足细胞丢失、蛋白尿以及炎症和纤维化分子的表达。miR-21拮抗剂可改善DN小鼠肾脏的结构和功能，是治疗糖尿病并发症的有效药物。CIVANTOS等[39]发现，作为二肽基肽酶-4(Dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)抑制剂的西格列汀，通过下调miR-200a/Keap-1/Nrf2信号通路,减轻DN大鼠miRNA介导的氧化应激。KANG等[40]研究发现，阿曲生坦可以降低miRNA-199b-5p的表达，增加klotho水平，klotho是一种抗衰老的单通道蛋白质，可以调控胰岛素敏感性。miRNA-199b-5p介导的血清klotho水平升高，可能是阿曲生坦预防DN患者肾小管损伤的机制之一。提示miRNA可作为DN分子标志物和治疗靶点。

4 结语与展望

miRNA在各种疾病中的研究越来越广泛,其重要价值已逐渐被科学家们所证实。其参与疾病的发生、发展过程，可作为疾病监测、诊断、治疗的新靶点。miRNA通过参与肾小球系膜细胞肥大、足细胞损伤、肾小管间质纤维化等导致DN的发生及进展。随着miRNA在DN研究领域的不断深入，期待miRNA作为敏感及特异的生物标志物早日在临床用于DN早期诊断及病情监测。