儿童急性淋巴细胞白血病化学治疗常规药物耐药机制的研究进展

林艳艳，许 岩，李 慧

上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心儿科转化医学研究所，国家卫生健康委员会儿童血液肿瘤重点实验室，上海200127

儿童白血病是血液系统的侵袭性肿瘤，在我国15 岁以下儿童死亡原因中居于第二位。基于登记系统大数据分析，我国15 岁以下儿童白血病发病率约为4/10 万，每年新增的15 岁以下儿童白血病的病例在1.5 万例左右［1］。白血病的各种类型中急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）比例最高，占儿童白血病的72.4%，也是儿童中发病率最高的恶性肿瘤，约占所有儿童癌症的三分之一［2］。近10 年来，随着儿童白血病精细化分型和规范化治疗在全国范围内的推广，ALL 患儿的远期预后极大地提高。上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心（下称上海儿童医学中心） 2015 版ALL 治疗方案（Shanghai Children's Medical Center-ALL-2015，SCMC-ALL-2015方案）的临床研究［3］结果显示，我国ALL 患儿5 年无事件生存率达80.3%，总生存率为91.1%；尽管如此，其与发达国家相比仍有一定的差距［4］。同时SCMC-ALL-2005 方案长期生存分析［5］表明，1 497 例ALL 患儿中有289 例（19.3%）复发，5 年、10 年复发率分别为（23.0±1.0）%和（25.0±2.0）%。国际上亦有20%～30%的ALL 患儿产生复发现象［6］，据报道复发的B 细胞型ALL（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）患者的生存率只有50%左右［7］。明确耐药复发的机制，早期诊断、及时干预、有效的针对性治疗，对于进一步降低ALL患儿耐药复发的可能性至关重要。

儿童ALL 的化学治疗（化疗）药物种类繁多，在治疗ALL 的过程中发挥着不同的作用，能够影响基因的表达、干扰核酸和蛋白质的合成、促使细胞结构和功能的改变等。使用不同类别的药物进行治疗，疾病耐药复发的机制也有所不同。本文总结了ALL细胞耐受常规化疗药物的可能的相关机制，旨在了解白血病细胞耐药的分子基础，为克服耐药的个体化治疗、设计相应的干预方案提供思路。

1 儿童ALL常规化疗药物

由上海儿童医学中心牵头组建，全国最大规模的中国儿童肿瘤专业委员会急性淋巴细胞白血病多中心协作组（Chinese Children's Cancer Group Study-ALL，CCCG-ALL），在CCCG-ALL-2015 治疗方案（临床注册号：ChiCTR-IPR-14005706）的基础上进行了19项修改，发布了新的CCCG-ALL-2020 方案（临床注册号：ChiCTR2000035264）。美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network， NCCN）也发布了2020 版儿童ALL 指南［8］。相比于其他肿瘤，ALL 对细胞毒性药物的反应更好，各种细胞毒性药物已被成功应用于ALL 的临床治疗中。全球各地儿童ALL 治疗方案略有不同，典型的儿童ALL 治疗方案包括诱导化疗、巩固治疗和维持治疗3 个阶段［9-10］。目前，儿童ALL 常规化疗药物包括激素类、抗代谢类、生物碱类和蒽环类药物，如糖皮质激素（glucocorticoid， GC）、 氨 甲 蝶 呤（methotrexate，MTX）、6-巯基嘌呤（6-mercaptopurine，6-MP）、硫唑嘌呤（azathioprine，AZA）、6-硫鸟嘌呤（6-thioguanine， 6-TG）、 左 旋 天 冬 酰 胺 酶 （Lasparaginase， L-ASP）、 长 春 新 碱 （vincristine，VCR）和柔红霉素（daunorubicin，DNR）等。

2 儿童ALL常规化疗药物耐药相关机制

在ALL 的治疗过程中，有相当一部分患儿出现了耐药现象，是导致预后不良的重要原因。部分患儿对某些化疗药物具有先天耐药性，这部分患儿的耐药可以通过联合使用其他化疗药物或加大药物使用剂量来克服。还有一些患儿是在使用化疗药物一段时间后才发生的获得性耐药，导致ALL 的复发，这是治疗失败最常见的原因［9］。导致ALL 细胞对各类化疗药物产生耐药的机制涉及了基因异常表达、信号通路异常调控、转录后异常修饰等。

2.1 激素类药物的耐药机制

GC 是儿童ALL 化疗中的核心药物，属于细胞毒性药物。 常用的GC 类药物有地塞米松（dexamethasone， DEX）、 泼 尼 松 （prednisone，PRED） 等。细胞质内的GC 受体（glucocorticoid receptor，GR）可以结合GC 类药物，随后转移至细胞核，与特定的基因位点结合，最终激活促凋亡因子表达。

大量研究已经证实了细胞的GR 表达异常、基因组不稳定、转录后调控异常、信号通路调节异常、代谢重编程、RNA 差异剪接、自身抵抗等可影响GC类药物的治疗效果。

GC功能性受体的数量可以直接影响细胞对于GC的敏感性。多项研究［11-13］表明，编码GR 的关键基因核受体亚家族3C 组成员1 （nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，NR3C1）的突变在GC耐药的进程中发挥着直接作用。同时，研究［9］发现一些微RNA（microRNA，miRNA）的表达变化可以在转录后水平调控耐药相关基因，介导治疗过程中细胞对GC 类化疗药物的耐受。其中有研究［14］发现，miRNA-124可以抑制NR3C1的表达，miR-124的高表达可诱导细胞耐药性，抑制DEX 诱导的细胞凋亡。同样地，LIANG 等［15］也发现PRED 耐药细胞系中miR-124的表达显著高于敏感细胞系，并验证了miR-124 通过抑制NR3C1表达引起ALL 的过度增殖和GC抵抗。

此外，信号通路和相关基因表观遗传学水平的调控异常，也可以引起细胞对GC 的耐受。多条信号通路，包括Notch、Janus 蛋白酪氨酸激酶/信号转导与转录激活子（the Janus kinase/signal transducer and activator of transcriptions，JAK/STAT）、鼠肉瘤病毒/迅速加速性纤维肉瘤/丝裂原细胞外信号调节激酶/细胞外信号调节激酶（the rat sarcoma virus/rapidly accelerated fibrosarcoma/ mitogen extracellular signalregulated kinase/extracellular signal-regulated kinase，Ras/Raf/MEK/ERK）级联通路和磷脂酰肌醇3激酶/第10 号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（the phosphati-dylinositol 3-kinase/phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten/protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/PTEN/Akt/mTOR） 等在ALL 中存在过度激活［16-17］，这些通路能够干扰GC 的促凋亡作用。各种报道显示，多种信号通路突变可通过调节B淋巴细胞瘤-2 相互作用细胞凋亡介导因子（B-cell lymphoma-2 interacting mediator of cell death，BIM）的表达，减少GC 诱导的ALL 细胞凋亡。有报道［18］证实，BIM 增强子的异常甲基化能够导致细胞对GC耐受，逆转DNA 甲基化的增强，在一定程度上可恢复细胞对GC 的敏感性。另外，NR3C1共激活因子环磷腺苷效应元件结合蛋白结合蛋白（the cyclic-AMP response element binding protein binding protein，CREBBP）的突变频率很高，它可导致包括GC 反应基因在内的CREBBP的靶基因产生组蛋白乙酰化和转录调控受损，干扰GC 药物的疗效［10］。POULARD等［19］也曾针对此类抗药机制进行了相关研究，结果显示抑制GR 共激活因子的去甲基化，可以恢复耐药细胞对GC 诱导的细胞死亡的敏感性，还可以减少大剂量GC治疗所引起的不良反应。

RNA 剪接失调是许多癌症的共同特征，同时也可影响药物反应。SCIARRILLO 等［16］发现GC 耐药的儿童ALL 样本表现出剪接模式改变，在此基础上作者研究认为靶向细胞RNA 剪接的治疗策略可以用于克服ALL 细胞对GC 类药物的耐受。在细胞代谢方面，STEEGHS 等［20］观察到IKAROS 家族锌指蛋白1（IKAROS family zinc finger 1，IKZF1）基因缺失与GC 耐药性之间高度相关，上调了细胞内三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和葡萄糖的水平，并且抑制糖酵解，可恢复PRED 药物疗效；作者认为这也可能是一种潜在的治疗GC 耐药ALL 的策略。在其他 方 面， RODERICK 等［21］证 明 前 列 腺 素E2（prostaglandin E2， PGE2） 激 活 的 环 磷 酸 腺 苷（cyclic adenosine monophosphate， cAMP） 信 号 与DEX 存在协同作用，两者联用可增强GC 耐药的T 细胞 型ALL （T-cell acute lymphoblastic leukemia，TALL）细胞的死亡，确定了PGE2 是儿童复发ALL 中再增敏GC 类药物的靶点。此外，也有研究［22］指出植物同源结构域指蛋白6 （the plant homeodomain finger protein 6，PHF6）具有转录抑制功能，直接与靶基因的启动子区域结合进而调控基因表达。XIANG 等［23］发现在T-ALL 中PHF6基因缺失依赖于P21的表达上调来产生对PRED 的耐受作用，而使用P21抑制剂可逆转该现象。

2.2 抗代谢类药物的耐药机制

2.2.1 叶酸拮抗剂类药物的耐药机制 MTX 作为常用的叶酸拮抗剂类药物，是儿童ALL 巩固和维持治疗方案中广泛使用的药物，可阻断核苷酸的生物合成和DNA复制，抑制肿瘤细胞的增殖。

叶酸多聚谷氨酸合成酶（folylpolyglutamate synthase，FPGS）可催化MTX 转化为MTX 多聚谷氨酸 盐（MTX-polyglutamate，MTX-PGn），MTX-PGn更容易贮存在细胞中，并且与底物二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）、胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）的亲和力明显高于单体MTX，因此细胞内MTX-PGn蓄积量的差异会影响药物治疗效果。换言之，FPGS 的活性及表达会影响MTX 的疗效。LIU 等［24］研究发现，β-连环蛋白（beta-catenin，β-catenin）可通过核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路下调FPGS 的表达，进而促进白血病细胞对 MTX 的耐药性。WOJTUSZKIEWICZ 等［25］发现由抑制叶酸代谢等的化疗药物诱导的FPGS 剪接缺陷是引起白血病叶酸拮抗剂抵抗的一种新机制，FPGS 的核内不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA）剪接异常可以导致FPGS活性丧失引起MTX耐药。

依赖ATP的药物外排转运体——如多药耐药蛋白1-5（multidrug resistance protein 1-5，MRP1-5）和乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP），其功能是主动排出有机阴离子，包括MTX、环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）、阿糖胞苷（cytosine arabinoside，araC）等化疗药物，从而降低细胞内药物浓度。JARAMILLO等［26］认为，MRP4和BCRP的过度表达促使MTX从细胞中排出，是ALL耐药复发的潜在机制。其中MRP4的变异与MRP4 的前信使RNA（pre-messenger RNA，pre-mRNA）的异常剪接［27］，可导致MRP4的异常表达，进而引起耐药。

另外有研究者［28-29］通过敲除富含AT相互作用功能5B（AT-rich interaction domain 5B，ARID5B）基因使细胞产生对MTX和6-MP的特异性耐药，进一步发现ARID5B在一定程度上是通过干扰细胞周期进程，来决定抗代谢药物敏感性的机制。已有研究［30］表明，细胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）也参与叶酸代谢的调控，其过度表达会扰乱正常的细胞周期，增加细胞周期相关转录因子E2F（early 2 factor，E2F）的释放来升高编码叶酸代谢酶的基因转录，这也是引起MTX耐药的机制之一。

2.2.2 硫嘌呤类药物的耐药机制 目前，维持阶段的ALL 治疗普遍应用以硫嘌呤类药物为基础的疗法，调查［31］显示，使用了最佳药物剂量强度并且依从度较高的患者，其无事件生存率明显提高。临床上用于治疗ALL 的硫嘌呤类药物主要包括6-MP、AZA、6-TG 等。硫嘌呤类药物进入体内后，经过一系列代谢酶的催化反应，形成有活性的代谢产物巯基鸟嘌呤核苷酸（thioguanine nucleotides，TGNs），TGNs可插入DNA中，诱导DNA损伤，进而引起肿瘤细胞凋亡。

现有研究发现硫嘌呤类药物耐药机制主要与其代谢过程有关，最常见的机制是细胞质5′核苷酸酶Ⅱ（cytosolic 5'-nucleotidase Ⅱ，NT5C2）和磷酸核糖焦磷 酸 合 成 酶 1 （phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1，PRPS1）的基因突变。NT5C2编码一种进化上保守且普遍表达的核苷酸酶，研究［31-34］发现NT5C2的激活突变与6-MP 治疗后ALL 的复发直接相关，NT5C2突变体使有细胞毒性的6-TGNs 去磷酸化，降低药物活性，引起ALL 细胞的耐药。BARZ等［35］通过对455 例复发患儿测序分析发现，与无NT5C2突变的患儿相比，具有NT5C2突变克隆或亚克隆的患儿预后较差。

PRPS1是核苷酸合成的关键酶，用来催化核苷酸生物合成途径中限速的第一步反应［36］。本课题组前期在配对B-ALL 样本中进行全外显子测序，发现BALL 患儿中存在嘌呤合成限速酶PRPS1 的复发特异性突变［37］。我们认为功能激活型PRPS1突变体持续激活嘌呤从头合成途径，使下游代谢产物次黄嘌呤异常积累，最终竞争性地抑制化疗药物6-MP和6-TG的功能，特异性削弱嘌呤类似物的疗效，导致ALL 耐药复发。此外，实验结果显示在体外可以使用嘌呤合成途径的抑制剂来克服ALL细胞的耐药性。

DNA 错配修复关键基因mutS 同源物6（mutS homolog 6，MSH6）的低表达可以造成DNA 错配修复系统的级联信号无法正常传递，导致细胞对化疗药物6-MP 的敏感性降低，降低药物引起的白血病细胞凋亡［38］。另外，YU 等［39］研究结果表明，硫嘌呤类药物结合使用MTX 可增加6-MP 向TGNs 的转化，并且MTX多谷氨酰化程度降低不仅会影响MTX的抗白血病效果，还会交叉影响6-MP的活性。

2.2.3 促氨基酸代谢类药物的耐药机制 天冬酰胺（asparagine，ASN）是ALL 细胞生长所需要的氨基酸之一。与正常细胞不同，白血病细胞自身无法合成ASN，当细胞外基质缺乏ASN时肿瘤细胞的蛋白质合成和增殖将被遏制；而正常细胞可以上调天冬酰胺合成酶（asparagine synthetase，ASNS）进行ASN 的生物合成，维持胞内ASN的供给。临床常用化疗药物LASP可迅速耗竭血浆ASN，干扰细胞周期和ASN依赖性蛋白的生物合成，发挥杀死肿瘤细胞的作用。

早期研究发现使用L-ASP后异常激活肿瘤细胞内的ASNS 是其耐药的主要机制，多年来研究人员发现了更多的耐药机制。LEE等［40］运用全基因组RNA干扰（RNA interference，RNAi）筛选，确定了亨廷顿蛋白相关蛋白1 （huntingtin-associated protein 1，HAP1）的缺失通过下调Ca2+介导的凋亡通路，阻止L-ASP诱导的细胞凋亡，引起肿瘤细胞耐药。

此外，耐药细胞可以利用体内的蛋白质降解后生成的ASN 来维持细胞增殖，产生L-ASP 耐药。HINZE 等［41］筛选全基因组发现，Wnt 信号通路的激活与L-ASP 联合使用对肿瘤细胞具有合成致死的作用。作者表明，Wnt介导的L-ASP敏感化并不依赖βcatenin，而是依赖于Wnt介导的蛋白质稳定性（Wntdependent stabilization of proteins，Wnt/STOP），遏制糖原合酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）依赖的蛋白质泛素化与蛋白酶体降解，减少蛋白质降解生成的ASN，因而Wnt 途径激活可提高不同耐药亚型ALL 细胞的L-ASP 敏感性。 同样地，WILLIAMS 等［42］借助代谢组学等方法筛选出转录因子锌指和BTB 结构域包含蛋白1 （zinc finger and BTB domain containing 1，ZBTB1），在后续实验发现ZBTB1可以特异性地在T-ALL 细胞中促进ASNS 转录进而诱导L-ASP 耐药，同时ZBTB1的缺失可使耐药T-ALL细胞对L-ASP敏感。

2.3 生物碱类药物的耐药机制

常用的生物碱类药物主要有VCR、长春地辛、长春碱等。VCR 是一种抗微管生物碱类药物，可破坏有丝分裂过程中微管组织形成的纺锤体，使恶性细胞的有丝分裂进程停滞，抑制癌细胞的活跃增殖。可单独或与其他药物联合使用，对于包括ALL 在内的多种肿瘤疾病疗效显著。目前对于VCR 在ALL 中的耐药机制的报道较少，多与介导药物外排的转运体产生的多药耐药相关。

ABERUYI等［43］注意到耐受MTX 的ALL细胞系对于VCR、GC 等药物具有交叉耐药性，认为可能的原因是三磷酸腺苷结合盒（ATP-binding cassette，ABC） 转运蛋白家族过度表达和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT） 相关基因选择性失调，导致药物外流增加。多年来的研究证明外排转运体的过度表达能够使细胞对VCR、CTX、DNR 等多种细胞毒性药物交叉耐受。VCR 是多种药物外排转运体的底物， 包括P- 糖蛋白（Pglycoprotein，P-gp）。FU 等［44］在对特异性耐受VCR的ALL 变异细胞系的研究中，发现复发ALL 的耐药性与P-gp 的过度表达显著相关。P-gp 是最早被发现与耐药有关的ABC 转运蛋白［45］，也是研究最多的一类外排转运体；其作用研究最为明确，对P-gp 进行抑制可以增加药物在耐药细胞中的蓄积。

在胃癌和结直肠癌等的研究［46-47］中，已经发现几种致癌的miRNA 与VCR 抗性有关：如miR-19a/b可通过抑制靶基因PTEN的表达来增强胃癌细胞的VCR 抗性；同时具有抑癌功能的miRNA 能够逆转癌细胞对VCR 的抗性，如miR-222 可以沉默去整合素-金属蛋白酶17（a disintegrin and metalloprotease 17，ADAM17）的表达使耐VCR 的大肠癌细胞对VCR 增敏，miR-129-5p、miR-508-5p 和miR27b 可 以 沉 默ABC 转运蛋白使耐药胃癌细胞恢复VCR 敏感性。然而更多的VCR 耐药性机制有待进一步的研究揭示，以指导临床治疗策略。

2.4 蒽环类药物的耐药机制

DNR能够抑制细胞RNA和DNA的合成，是一种能在细胞周期各个阶段发挥细胞毒作用的蒽环类抗肿瘤化疗药，是许多急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）治疗方案中的关键成分。目前关于蒽环类化疗药研究的耐药机制主要涉及5 个方面——拓扑异构酶Ⅱ活性改变、肿瘤细胞干性形成、DNA修复改变、代谢适应以及前文提到的药物外排转运体过度表达等［48］。

醛酮还原酶1C3 （aldo-keto reductase family 1 member C3，AKR1C3） 是 醛 酮 还 原 酶（aldo-keto reductases，AKR）超家族的一员，与体内类固醇代谢密切相关；其过度表达能使蒽环类药物代谢为效力较低的C-13 羟基代谢物，进而降低药物产生的细胞毒作用［49-50］。MORELL 等［49］发现在AML 中，抑制Bruton酪氨酸激酶（Bruton tyrosine kinase，BTK）能够逆转AKR1C3 介导的DNR 失活，证明了BTK 抑制剂与DNR 具有很好的联合治疗作用。另外，环磷腺苷效应元件结合蛋白（the cyclic-AMP response element binding protein，CREB）是一种能刺激基因转录的反式激活因子，GAO等［51］认为增殖率低的肿瘤细胞对化疗不敏感，其研究揭示CREB 的结合蛋白CREBBP 下调可限制细胞周期S 期的进入，显著抑制白血病细胞增殖，并引起细胞对DNR 耐药，而CREBBP的过表达显著加速了细胞增殖。P-gp转运体同样能够识别DNR，将其从细胞中移除。

3 总结与展望

ALL 已经成为威胁儿童健康的重要疾病，而耐药复发是儿童ALL 治疗失败和死亡的主要因素，也是临床治疗的瓶颈，是国内外儿童ALL 领域研究的热点与焦点。研究人员利用全基因组筛选、代谢组学等先进手段，发现与ALL 耐药复发相关的基因变异和多种相互交叉、复杂交织的机制，并提出针对性治疗方案，逐步提高了患儿的治愈率和生活质量。基因组变异、转录后修饰、表观遗传学漂移、核酸代谢、代谢酶的修饰、细胞周期及信号通路异常等多种因素，均可成为治疗儿童ALL 耐药复发的关键靶标，或将为建立患儿的个体化精准化疗方案提供帮助。