丁苯酞及其衍生物在脑缺血再灌注损伤中的保护机制

潘茁丽，成美芳，马静萍

脑卒中具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点，其中缺血性卒中占全部脑卒中的70%～80%[1]。目前缺血性卒中急性期的治疗原则仍为尽早恢复缺血脑组织的血流灌注，拯救缺血半暗带。临床上常采取的血管再通手段在使脑血管再通的同时也可能造成脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）。其发病机制主要包括氧化应激、炎症破坏、线粒体功能障碍、钙超载与谷氨酸兴奋性毒性、细胞凋亡等[2]。

丁苯酞是从芹菜籽中提取并人工合成的光学异构体，目前被广泛应用于急性缺血性脑卒中的治疗[3]。研究发现丁苯酞及其衍生物具有缓解CIRI的作用，现对其机制的研究成果综述如下。

1 保护血脑屏障，减轻脑水肿

血脑屏障由内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞及细胞外基质组成，其中内皮细胞间的紧密连接是血脑屏障最重要的结构[4]。紧密连接水平和小窝介导的囊泡转运参与调节内皮细胞的通透性[5]。Li等[4]发现丁苯酞可以抑制脑缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）后 紧 密 连 接 蛋 白 如claudin-5、occludin、ZO-1 等的减少及小窝蛋白-1（CAV-1）的升高，从而降低血脑屏障的通透性、减轻脑水肿。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）可以降解细胞外基质的多种蛋白，在CIRI 大鼠中丁苯酞可抑制MMP-9 的表达而增加MMP 组织抑制因子1表达，缓解血脑屏障的损伤[6]。

2 改善脑微循环

微血管功能障碍是CIRI 中的重要因素，可表现为血管收缩、血栓形成、血流灌注减少等[7]。肾素-血管紧张素系统和血栓形成系统参与脑缺血后大脑微循环的调节。Qin等[8]发现脑I/R后肾素、血管紧张素原、血管紧张素转换酶1及其下游效应因子血管紧张素II 受体1 型和RhoA 蛋白的表达增加，而丁苯酞可以通过抑制上述因子变化发挥血管舒张作用，同时可降低血栓素A2合酶/前列环素合成酶的比值，减少血栓形成风险。Huang 等[9]的研究表明丁苯酞可通过提高核转录因子Nrf2、缺氧诱导因子-1α、血管内皮生长因子的表达水平促进新生血管的生成。Wang等[10]的研究提出，Dll4/Notch通路也参与丁苯酞促进血管生成的过程。

3 抑制氧化应激

氧化应激主要表现为活性氧（reactive oxygen species，ROS）与抗氧化因子的失衡。过量的ROS氧化细胞内脂质、蛋白质、DNA，导致细胞死亡[11]。ROS 的来源包括NADPH 氧化酶、黄嘌呤氧化酶等，相对的抗氧化因子有超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶等[12]。Zhou等[13]合成的丁苯酞类似物5d 可以通过促进蛋白激酶CK2 的表达抑制细胞质亚基Rac1 与CK2α的解离，阻止Rac1、p47phox易位至细胞膜，抑制NADPH 氧化酶的激活，从而减少脑I/R 后ROS 的产生。丁苯酞的另一种衍生物8e 通过抑制P13Kγ/AKT 通路减少NADPH 氧化酶2 亚基p47phox 的表达及磷酸化，减少超氧化物的产生[14]。Yin 等[15]将开环丁苯酞与H2S、NO 供体合成一种新的衍生物，其可增加CIRI 大鼠中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶的含量增加而脂质过氧化产物丙二醛的产生减少，且神经保护作用强于丁苯酞。近期研究人员将开环丁苯酞及依达拉奉类似物合成一种杂合分子10a，发现10a 可通过Nrf2 途径调节下游的抗氧化酶如血红素氧合酶）、NQO1，以此减轻氧化损伤[16]。因此，丁苯酞及其衍生物主要通过维持I/R 后脑内氧化与抗氧化系统的平衡实现神经保护作用。

4 抑制炎症破坏

I/R 后过度的炎症被激活进一步破坏缺血后脑组织，而丁苯酞的作用在于调节炎症的程度。丁苯酞可以抑制缺血区中性粒细胞的浸润，抑制IL-1β、IL-6、CCL2、CCL3、TNFα等炎性因子的释放以及细胞间粘附分子-1的表达，从而减轻炎症损害[17]。核转录因子-κB（NF-κB）及p38/丝裂原活化蛋白激酶（p38/MAPK）作为炎性因子的上游在脑I/R后发生磷酸化，丁苯酞可抑制上述因子的活化，在转录水平上减轻炎症反应[18]。丁苯酞衍生物CD21 可以抑制高迁移率簇蛋白B1 介导的TLR4/NF-κB 通路及组织蛋白酶B 介导的NLRP3/ASC/Caspase-1 通路，进而阻止NLRP3炎性小体的激活[19]。小胶质细胞是脑缺血后最先响应的免疫细胞之一，其活化后有2 种表型：促炎性的M1型和抗炎性的M2型，目前的观点认为平衡MG的亚型有助于减轻神经损伤[20]。近期一项关于CD21的研究指出AMPK通路参与调节MG 的极化方向，研究发现CD21 通过提高腺苷酸激活蛋白激酶的磷酸化水平减少M1 亚型的标志物如CD86、IL-1β和诱导型一氧化氮合酶的表达，增加M2亚型的标志物如CD206、IL-10和YM1/2的表达，并促进M2型MG分泌抗炎因子IL-10，抑制M1 型MG 分泌炎性因子IL-1β、IL-6、TNFα，以此发挥抗炎作用[21]。

5 保护线粒体功能

线粒体是CIRI 的关键细胞器，涉及CIRI 中的多个机制如ROS的产生、能量代谢障碍、线粒体途径的细胞凋亡等，是调控细胞存活及疾病转归的关键因子[22]。Chen等[23]发现丁苯酞具有稳定线粒体膜电位、提高线粒体呼吸链复合物与ATP 酶的活性、平衡线粒体的分裂与融合等作用。Zhao等[24]发现丁苯酞衍生物(S)-ZJM-289 可以促进抗凋亡蛋白bcl-2 的表达，抑制促凋亡蛋白bax向线粒体膜易位及凋亡诱导因子（AIF）的核易位，减少细胞色素C的释放，进而抑制线粒体途径的细胞凋亡。颜秀丽等[25]发现丁苯酞可以通过调节线粒体蛋白如细胞色素C氧化酶A2、烟酰胺核苷酸转移酶、解偶联蛋白3 的表达水平维持线粒体能量代谢。

6 减轻谷氨酸兴奋性毒性与钙超载

谷氨酸是中枢神经系统重要的兴奋性神经递质，谷氨酸-谷氨酰胺循环维持正常神经元内谷氨酸的低水平状态。I/R后脑内谷氨酸含量升高，在突触中积聚的谷氨酸激活离子型受体N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR），引起Ca2+通道开放，导致细胞内Ca2+超载，加重脑组织损伤[26]。目前关于丁苯酞减轻谷氨酸兴奋性毒性的作用机制尚不明确。对于急性缺血性脑卒中患者丁苯酞处理可以降低体内谷氨酸含量减轻神经功能缺损[27]。但有研究发现在Na+/Ca2+交换体和兴奋性氨基酸转运体的作用下谷氨酸可以刺激神经元复氧后的氧化代谢[28]，这表示神经元内的谷氨酸为保护因子，而兴奋性毒性主要是通过刺激受体实现的。Luo等[29]认为神经保护剂不能通过阻断NMDAR减轻CIRI，而NMDAR与电压门控Ca2+通道亚单位α2δ-1的结合可以作为新的干预靶点。

7 调节神经发生

传统的观点认为成熟神经元的再生能力很低，但近年来的研究提出成年人的大脑中仍有神经发生。在海马齿状回的亚颗粒区和侧脑室的脑室下区存在具有增殖分化潜能的神经干细胞（neural stem cells，NSCs）。在缺血缺氧时NSCs 可被激活进行增殖和迁移，新生细胞逐步分化成熟并且建立突触联系[30]。Yang等[31]发现丁苯酞可以激活I/R后受损半球海马齿状回中的NSCs，促进神经前体细胞增殖，并提高新生细胞存活率，调节NSCs向神经元方向分化，改善突触可塑性。有研究提出丁苯酞可激活脑源性神经营养因子（brain derived neurophic factor，BDNF）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）及表皮生长因子受体介导的相关通路，促进神经细胞生长锥及突触形成，减轻I/R 诱导的突触受损，增加神经突起的数量、分支及长度[32]。也有研究显示丁苯酞可以通过BDNF/TrkB/CREB 与P13K/Akt通路促进NSCs的增殖、迁移、分化[33]。Sun等[34]提出丁苯酞可以促进脑缺血后皮质脊髓束向损伤区生长，对脑室下区的神经发生起积极作用。近期的一项研究中提出丁苯酞促进神经突起生长发育的作用与生长相关蛋白-43的表达、Sonic Hedgehog(Shh)通路的激活有关[35]。白小梅等[36]发现丁苯酞对于神经髓鞘也有一定的保护作用，表现为提高髓鞘碱性蛋白的表达水平、抑制髓鞘相关糖蛋白的表达，从而减轻I/R诱导的髓鞘损伤。

8 抑制细胞死亡

现有的研究表明脑I/R 诱导的细胞死亡形式包括坏死、细胞凋亡、自噬、焦亡、坏死性凋亡等[2]。Xu 等[37]的试验表明丁苯酞可以通过P13K/Akt/mTOR通路提高bcl-2/bax的比值、降低自噬标志蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及beclin-1的含量，同时抑制凋亡与自噬2 种神经细胞死亡形式。p38 是MAPK 家族的成员，参与炎症、细胞凋亡及生长，Liao 等[38]认为丁苯酞可以抑制p38/MAPK 通路诱导的细胞凋亡。刘伟等[39]发现经丁苯酞处理后CIRI大鼠脑内PARP-1及AIF表达减少，Parthanatos样细胞死亡受抑制。细胞坏死性凋亡与经典的细胞坏死、凋亡不同，表现为细胞器肿胀、细胞膜破裂、有炎性反应等，其过程受受体相互作用蛋白（RIP）的调控。郭生龙等[40]的研究发现丁苯酞可以减少RIP1、RIP3的表达、阻止AIF与RIP3的结合及核转移，从而抑制脑I/R诱导的细胞坏死性凋亡。

9 小结

丁苯酞及其衍生物具有保护血脑屏障、改善微循环、抑制氧化应激及炎症破坏、调节神经发生、抑制细胞死亡等的药理作用。目前的研究发现丁苯酞不仅可以用于急性缺血性脑卒中的治疗，对于阿尔兹海默病、血管性痴呆、帕金森病、肌萎缩侧索硬化等神经内科常见病也有改善神经功能的作用；此外，对于非神经系统疾病，丁苯酞也有一定的药用价值。丁苯酞的作用机制较为复杂，涉及多种分子及信号通路，并且作用广泛，仍需进一步探索。