程序性细胞死亡在代谢相关脂肪性肝病中的研究进展

夏煜寒，蔡浩，顾劲扬（上海交通大学医学院附属新华医院移植科，上海 200030）

脂肪性肝病分为酒精性脂肪肝病和非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD），后者与代谢障碍密切相关。以往诊断NAFLD 需排除其他可能引起肝脏损伤的因素，且NAFLD 这一定义无法体现该病的内涵［1-2］。近年来，随着代谢功能障碍相关脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease， MAFLD）这一概念的提出，更准确的反映了脂肪肝的病因及病理生理过程，因此这一概念已被更多学者所接受。MAFLD 这一新的定义从原先的排他性诊断标准转向为肯定性诊断标准，即存在代谢功能障碍而非排除其他肝损因素，从而将代谢功能障碍明确列为脂肪性肝病的重要病因［3-4］。这一概念更好地定义了MAFLD 患者群体，并有助于患者的疾病分型，从而为个体化诊疗和高级别临床研究提供便利。因此，在本文中使用MAFLD 这一概念代替脂肪肝。

在许多情况下均有细胞死亡的发生，包括发育、代谢、癌症和缺氧损伤。目前已知的（programmed cell deaths， PCD）主要包括细胞凋亡、坏死性凋亡、细胞焦亡、铁死亡等。不同的PCD 方式在MAFLD发生发展过程中发挥了不同的作用。在正常肝脏中，凋亡的肝细胞占总肝细胞的比例低于0.05%，肝细胞凋亡与再生之间微妙的平衡调节着肝脏的功能与稳态。目前，大部分现代肝病往往由慢性疾病引起，如MAFLD、慢性病毒性肝炎等。在这些情况下，各种PCD 的增加可能是上述慢性疾病过程的关键驱动因素。因此，准确的了解PCD 的机制对理解MAFLD 的病理生理过程以及新疗法的开发至关重要。

1 细胞凋亡

1.1 细胞凋亡的特征与机制：Kerr 等［5］最先提出细胞凋亡广泛存在于多种疾病的发生发展过程，包括感染、药物毒性反应、缺血/再灌注、免疫炎症反应等，其发生机制主要分为内外两个途径，外部死亡受体途径主要由肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor， TNF）超家族的成员介导，于细胞膜上形成凋亡诱导复合物，进而导致细胞凋亡［6］。线粒体释放细胞色素C 是细胞凋亡内部线粒体途径的关键步骤，释放到胞浆的细胞色素C 在ATP 存在的条件下与凋亡相关因子1 结合，促使半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9（Caspase-9）与其结合形成凋亡小体，诱发凋亡。

1.2 细胞凋亡与MAFLD 的联系：研究发现，MAFLD患者肝组织的免疫组化检测显示其caspase-3和TUNEL 染色均呈阳性，表明MAFLD 患者肝脏中发生了细胞凋亡，并且MAFLD 患者的肝细胞凋亡标志物表达水平与严重程度相关［7］。因此，可以通过检测活化的Caspase-3 及角蛋白酶-18 片段的含量初步诊断MAFLD［8］。最近的研究表明，在脂肪肝小鼠模型中，Caspase-2、3 缺失可减少细胞凋亡并抑制MAFLD 的形成［9］。无独有偶，Ferreira 等［10］发现严重MAFLD 患者活化的Caspases-2、3 水平显著高于单纯脂肪变性患者。其次，使用泛半胱氨酸天冬蛋白酶抑制剂VX-166，可显著减轻脂肪肝小鼠的肝损伤和肝纤维化。一致的是，在一项临床试验中，口服抑制Caspase 1、8、9 可以使NASH 患者丙氨酸转氨酶水平降低［11］。目前正在进行的大型临床随机试验的还有恩卡利生，该药物是一种泛Caspase 的抑制剂，用于治疗肝病，包括移植后肝脏保护，慢性病毒性肝炎以及MAFLD，该药物已在几个早期临床试验中进行了测试，并下调了MAFLD患者肝转氨酶水平［12］。综上所述，凋亡是MAFLD形成中的重要一环，抑制凋亡可减轻MAFLD 的病症并抑制MAFLD 的形成。

2 细胞焦亡

2.1 细胞焦亡的特征与机制：相比于细胞凋亡，细胞焦亡发生的更快，并会伴随着大量促炎症因子的释放。形态学上焦亡的细胞会发生肿胀，细胞核固缩及DNA 断裂，在细胞膜上形成孔隙，释放内容物，引起炎症反应［13］。细胞焦亡的发生主要分为依赖Caspase-1 的经典途径和依赖Caspase-4、5、11的非经典途径。在经典的焦亡途径中，损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns， DAMPs）被细胞内的核苷酸寡聚化结构域（nucleotide binding and oligomerization domain， NOD）样受体识别［14］，通过接头蛋白与Caspase-1 的前体结合并活化。一方面，活化的Caspase-1 切割Gasdermin D（GSDMD），形成含有GSDMD 氮端活性域的肽段，诱导细胞膜穿孔释放内容物并引起炎症反应；另一方面，活化的Caspase-1 对IL-1β 和IL-18 的前体进行切割，活化的IL-1β 和IL-18 募集炎症细胞并扩大炎症反应［15］。在非经典的焦亡途径中，活化的Caspase-4、5、11 即可直接诱导细胞焦亡的发生，也可切割GSDMD，形成含有GSDMD 氮端活性域的肽段，诱导细胞焦亡［16］。

2.2 细胞焦亡与MAFLD 的联系：Zhong 等［17］发现在胆碱-蛋氨酸缺乏饮食（methionine and choline deficient diet， MCD）小鼠模型中存在细胞焦亡，证明了减轻GSDMD 的表达可减缓MCD 的形成。Chen等［18］发现NLRP3 活化Caspase-1 并诱导IL-18和IL-1β 的表达，最终导致脂肪肝细胞焦亡的发生DAMPs 的释放。目前主流观点认为IL-1β 是促进MAFLD 形成的细胞因子。而Yamanishi 等［19］认为IL-18 对于肝脏中正常的脂质代谢至关重要，其缺陷反而导致脂肪积累，因此MAFLD 中肝细胞焦亡释放的IL-18 和IL-1β 可能是一把双刃剑。有研究表明，人体MAFLD 肝脏组织中GSDMD和GSDMD-N 水平较高，并且小檗碱可通过抑制ROS-TXNIP 轴，降低NLRP3、Caspase-1 的活性，对MAFLD 有显著治疗效果。而MCD 小鼠中敲除GSDMD 可减少NF-κB 的磷酸化和促炎细胞因子如TNF-α、IL-1 的表达，最终减轻脂肪肝的形成［20］。因此，抑制NLRP3 和GSDMD 的激活可以通过减少细胞焦亡发生，显著减轻炎症和纤维化，最终抑制MAFLD 的形成。但上述结论尚未得到临床药物实验的证实，因此通过抑制细胞焦亡来阻断MAFLD 的形成还需要大量的临床试验。

3 坏死性凋亡

3.1 坏死性凋亡的特征与机制：坏死性凋亡是一种依赖于受体相互作用蛋白激酶1（receptor interacting protein kinase 1，RIPK1）的细胞死亡方式。另有研究表明，受体相互作用蛋白激酶3（receptor interacting protein kinase 3，RIPK3）和混合谱系激酶结构域样假激酶（mixed lineage kinase domain-like，MLKL）也是坏死性凋亡的关键蛋白［21］。坏死性凋亡的激活主要由TNF-α 介导，使得RIPK1 和RIPK3 中的RIP 同型结构域相互作用，促进RIPK1 和RIPK3 磷酸化，进而导致MLKL 的寡聚及磷酸化，P-MLKL激活后插入细胞质膜，导致细胞膜破裂和包括IL-1α、IL-β 和IL-33 等DAMPs 的释放，从而引发炎症反应，加重组织损伤［22］。其中Caspase-8不仅是细胞坏死性凋亡的重要组成部分，还是一个引导细胞走向另一死亡方式的开关，Caspase-8 的激活促进细胞凋亡，而抑制Caspase-8 活性则使细胞走向坏死性凋亡。

3.2 坏死性凋亡与MAFLD 的联系：在正常生理条件下肝细胞RIPK3 的表达非常低，当细胞凋亡被阻断时，坏死性凋亡可能是替代的死亡机制［23-25］。Roh 等［26］发现MAFLD 患者血清中可以检测到P-MLKL、RIPK1、RIPK3 的升高，这表明MAFLD 患者肝脏中发生了坏死性凋亡。在脂肪肝动物模型的肝脏组织中TNF-α 和Toll 样受体4 明显升高，TNF-α 和Toll 样受体4 激活RIPK3 和MLKL，通过ASK1-JNK 介导的炎症和肝纤维化等促进了MAFLD 的形成［27］。研究发现，使用RIPK1特异性抑制剂RIPA-56 可显著减轻肥胖饮食小鼠的肝脏炎症与纤维化，并且可逆转肥胖小鼠肝脏的脂肪变性。但是Roychowdhury 等［28］研究发现，在脂肪肝动物模型中敲除RIPK3 反而加重了肝脏损伤、肝脏脂肪变性及炎症，并认为这一结果可能是通过加重细胞凋亡导致的。根据上述结论，似乎直接抑制RIPK3 激酶并不一定是治疗MAFLD 的理想方案，但靶向抑制RIPK1/MLKL 可能是一种很有潜力的MAFLD 治疗策略。因此，需要进一步研究RIPK3、RIPK1 和MLKL 在MAFLD 中发挥的作用，才能更好的从抑制坏死性凋亡及并发的炎症反应角度改善甚至逆转MAFLD。

4 铁死亡

4.1 铁死亡的特征与机制：2012 年Dixon 等［29］人研究发现Erastin 和RSL3 可特异性诱导Ras 突变细胞的死亡，其作用机制与过渡态铁的含量有关，并且铁螯合剂可抑制这一过程，故命名为铁死亡。铁死亡在细胞形态学上与凋亡、自噬、坏死等传统的细胞死亡方式有显著差异，主要表现为线粒体变小，膜密度增高，外膜消失而细胞核的形态变化不明显。目前普遍认为磷脂氢过氧化物（phospholipid hydroperoxides， PLOOHs）是铁死亡的执行者，其合成依赖于过渡态铁、ROS 及含有多不饱和脂肪酸链的磷脂（phospholipid with polyunsaturated fatty acid chain， PUFA-PLs），因此PLOOH 的清除可显著下调铁死亡的发生。PLOOH的清除有3 条途径：① 在经典的铁死亡调控通路中，胱氨酸通过胱氨酸/谷氨酸反向转运体进入细胞，经硫氧还蛋白还原酶1 还原生成半胱氨酸，促进谷胱甘肽（glutathione， GSH）生成。GSH是一种强效的还原剂，可作为谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4 ， GPX4）的辅因子，促进PLOOHs 还原为对应的醇［30-31］。② 铁死亡抑制蛋白1 （ferroptosis suppressor protein 1，FSP1）-泛醌系统可以保护细胞免受GPX4 基因敲除引起的铁死亡。FSP1 可通过催化泛醌还原为泛醇从而抑制脂质过氧化进而抑制铁死亡［32］。③ GTP 环化水解酶（GTP cyclohydrolase-1， GCH1）和二/ 四氢生物喋呤（dihydrobiopterin /tetrahydrobiopterin，BH2/BH4）介导的对脂质过氧化的抑制作用也可保护细胞免受铁死亡，在其中GCH1 和BH2/BH4可能作为内源性的自由基捕获型抗氧化剂发挥作用［33-34］。需要注意的是，在铁死亡过程中，最终介导细胞死亡的确切机制尚不清楚，可能与脂质交联导致细胞膜完整性被破坏以及来源于PUFA-PLs的ROS 引发的生物大分子的氧化损伤相关。

4.2 铁死亡与MAFLD 的联系：研究发现，MAFLD患者中存在不同程度的磷脂过氧化的代谢产物丙二醛和4-羟基壬烯醛的升高，并且脂质过氧化和过量的铁沉积可以通过增加铁死亡水平加剧MAFLD患者的炎症反应［35］。Imai 等［35］认为GPX4 抗氧化特性可能在MAFLD 中发挥关键作用，使用RSL-3抑制剂可通过脂氧合酶（lipoxygenases， LOXs）增加肝脏中的磷脂过氧化，诱发铁死亡，并且使用铁螯合剂可改善这一现象，说明MAFLD 中同时存在ALOXs 催化和铁催化的PLOOH。有文献表明，在MAFLD 患者血清中的白色脂肪二价金属转运蛋白含量升高，可通过促进二价铁在小肠中的吸收，增加肝细胞内铁的含量［36］。同时在脂肪肝小鼠模型中也检测到转铁蛋白受体1 的上调，它通过增加铁的摄入加重脂肪肝小鼠模型中铁死亡的发生［37］。结合上述研究不难发现，MAFLD 患者中铁的沉积与大量磷脂过氧化物的合成共同作用，加剧了铁死亡的发生并促进了MAFLD 的形成。这也提示，靶向抑制铁死亡可能是MAFLD患者的潜在治疗手段。

5 展 望

目前，大多数实验研究将各类细胞死亡方式作为独立的个体，单独研究其与MAFLD 的关联。但它们之间的分子机制和途径紧密联系，单独抑制某一PCD 可能疗效有限，甚至会加重其他方式的细胞死亡。因此，靶向多个细胞死亡途径可能比单一治疗方法更有效。此外，鉴于不同的细胞死亡途径之间的相互作用，以及考虑到调节一种PCD 途径可能会激活另一种PCD 的风险，如果对MAFLD 患者的治疗采用靶向调节细胞死亡的信号通路，如ASK1-JNK、GSH-GPX、FSP1-COQ10、线粒体自噬和炎症小体等，可能会比直接靶向抑制PCD 更有效、更安全、更可控。

6 总 结

在过去的10 年里，我们对脂肪肝的理解逐步深入，主要体现为其发病机制的逐步阐明：包括氧化应激和内质网应激，以及不同类型的PCD 在MAFLD 的形成及发病过程中发挥的作用。本综述通过文献检索，总结了MAFLD 形成中可能存在的PCD 及其研究进展，并推测未来MAFLD 的创新治疗方向可能包括直接或间接靶向抑制不同类型的PCD 以延缓甚至逆转疾病进程。尽管目前仍有许多问题亟待解决，但是本综述将为未来的研究方向提供重要的理论参考。