细胞自噬与PI3K/Akt/mTOR信号通路在黑色素瘤耐药性中的研究进展

秦文欣，王永晨

(哈尔滨医科大学附属第二医院皮肤性病科，哈尔滨 150086)

黑色素瘤又称黑素瘤，是一种起源于黑色素细胞的恶性肿瘤[1-2]，可发生于黑色素细胞存在的部位，常见于皮肤，亦可见于皮肤黏膜，具有侵袭性强、恶性程度高、预后差、易发生转移、对放化疗不敏感等特征[3-4]。近年来，黑色素瘤的发病率和病死率呈持续升高趋势。2019年，美国确诊新发黑色素瘤患者约96 480例，因黑色素瘤死亡约7 230例[5]。近年我国黑色素瘤患者也逐渐增多，黑色素瘤已经成为严重威胁我国人民生命健康的疾病之一[6]。研究表明，黑色素瘤的发生与黑色素细胞内的多种基因突变密切相关，其中v-raf鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B1(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF)基因突变率较高，一半以上的晚期黑色素瘤患者体内存在BRAF基因第600位的突变[7]。我国皮肤黑色素瘤患者也存在BRAF基因突变，且主要以第600位的突变为主[8]。针对突变BRAF基因的靶向药物包括威罗菲尼及达拉菲尼，其用于黑色素瘤治疗取得了显著进展，对于已经发生转移且无法行手术治疗的患者，基因靶向治疗起效快，患者远期生存率高，但靶向药物治疗后，大多数患者很快产生耐药[9-10]。现就细胞自噬及磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路对黑色素瘤可能产生耐药性的分子机制进行综述，以期为黑色素瘤耐药性的研究提供帮助。

1 黑色素瘤对基因靶向药物产生耐药

黑色素瘤的发生、侵袭、转移与细胞癌基因BRAF的突变激活密切相关[11]。目前检测到BRAF突变已逾30种，突变常发生在核酸序列第600位上，导致编码的缬氨酸突变成谷氨酸，即BRAF V600E突变，占80%以上。BRAF基因属于RAF家族，可编码一种丝/苏氨酸特异性激酶。此外，BRAF基因还负责细胞内的信号转导，指导细胞正常的生长、增殖、分化和生存。BRAF基因突变可导致细胞的生长、增殖、分化和代谢的改变。因此，发生BRAF V600E突变黑色素瘤患者的治疗反应较差、生存率低。鉴于以上问题，针对 BRAF V600E突变靶位的靶向药物相继问世，如威罗菲尼和达拉菲尼已被批准用于临床黑色素瘤的治疗[12]。这些靶向药物的使用在黑色素瘤患者的治疗中取得了重大突破。BRAF抑制剂可抑制促分裂原活化的蛋白激酶信号通路的异常激活，进而抑制黑色素瘤的增殖、转移及侵袭。在使用BRAF抑制剂治疗的早期试验中，靶向药物可通过刺激适应证患者的免疫能力，使黑色素瘤的瘤体迅速缩小。然而，大多数患者的疗效持续时间较短，黑色素瘤细胞很快对靶向药物产生耐药，耐药性的产生在很大程度上降低了黑色素瘤细胞对药物的敏感性，故黑色素瘤重新生长。因此，揭示BRAF抑制剂的耐药性机制并解决BRAF抑制剂的耐药问题，成为治疗BRAF V600E突变黑色素瘤亟待解决的问题。

2 细胞自噬与黑色素瘤耐药的相关性

近年来，细胞自噬在黑色素瘤的发病机制和治疗中的作用受到广泛关注，细胞自噬水平升高可能维持黑色素瘤细胞的活力并导致其耐药性产生，而对细胞自噬的深入研究有助于更好地理解黑色素瘤的发病机制及耐药的相关性。

2.1细胞自噬 细胞自噬是细胞内一种重要的生物代谢途径，其进化过程高度保守。细胞自噬通过溶酶体降解自身的细胞内容物，属于溶酶体降解途径。机体通过细胞自噬对细胞内废弃或受损的生物大分子及细胞器进行清除、降解以及回收利用，细胞自噬的存在有利于细胞内成分的循环利用，对维持细胞内稳态有重要作用[13-14]。细胞自噬可以“基础性细胞自噬”和“诱导性细胞自噬”两种不同形式被激活[15]。在生理条件下，“基础性细胞自噬”作为细胞内质量控制途径发挥作用，有利于细胞质成分的周转；“诱导性细胞自噬”通常在一些不利条件下被激活，当细胞的营养和生长因子被剥夺、病原体感染和能量消耗时，为满足细胞应激期间的营养需求，“诱导性细胞自噬”常被激活。“基础”和“诱导”类型的细胞自噬对于维持细胞存活和体内平衡至关重要。在哺乳动物中，细胞自噬的发生途径为伴侣介导的自噬、微自噬、巨自噬3种，其中巨自噬与黑色素瘤的关系更为密切，下文所述自噬均为巨自噬。

2.2细胞自噬在肿瘤形成过程中的不同作用 自噬在肿瘤中的作用高度复杂，且尚有争议[16]。自噬在肿瘤形成过程中的作用具有两面性，既可发挥促进作用，又可发挥抑制作用[14]。“基础性细胞自噬”对早期肿瘤细胞有抑制作用[17]。在早期肿瘤细胞内，自噬通过稳定细胞内的基因序列保护基因组免受伤害，从而减少肿瘤细胞的产生与发展。当肿瘤细胞内自噬水平过高时，自噬性细胞死亡以非依赖性细胞凋亡方式抑制肿瘤细胞的增殖，且自噬不仅可为T细胞免疫反应提供能量，还可影响抗原交叉呈递，且自噬小体是肿瘤抗原的有效载体之一，有利于早期肿瘤细胞的清除。“诱导性细胞自噬”对晚期肿瘤细胞有促进作用。在晚期肿瘤细胞内，自噬可增强肿瘤细胞的抗凋亡能力，当肿瘤细胞处于乏氧、饥饿、感染、物理损伤等不良环境时，细胞内自噬激活、耐受力增强，这有助于维持细胞稳定[14]。当手术、放疗及化疗时，“诱导性细胞自噬”通过促进肿瘤细胞的自身休眠引发治疗抵抗，这是肿瘤复发和远处转移的原因之一[18]。综上，在肿瘤发生早期阶段，自噬可能有助于控制或杀死癌细胞，而对于已经发展的晚期肿瘤细胞，抑制自噬可以阻断其促进肿瘤的作用。

2.3细胞自噬可增加黑色素瘤细胞的耐药性 在恶性黑色素瘤细胞中，自噬的上调可能增加其耐药性。研究报道，有些已经癌变的细胞可以利用“诱导性细胞自噬”的保护作用避免因药物和电离辐射等治疗造成的伤害，使癌变细胞产生耐药性，甚至导致肿瘤复发[18]。在黑色素瘤小鼠模型中，自噬相关蛋白5的杂合缺失增强了黑色素瘤对BRAF抑制剂达拉菲尼的有效反应[19]，因此自噬抑制剂被认为是一种提高黑色素瘤细胞对治疗敏感性的有效策略。在使用BRAF抑制剂单独治疗或联合促分裂原活化的蛋白激酶激酶抑制剂治疗的黑色素瘤患者中，有74%的患者自噬水平增高，联合使用自噬抑制剂后，黑色素瘤患者对BRAF抑制剂的药物敏感性提高；此外，还可通过抑制自噬相关基因Beclin1靶向抑制自噬，使自然杀伤细胞渗入黑色素瘤，以提高化疗效果、增强肿瘤的免疫反应[15]。Möller等[20]发现，抑制自噬可抑制黑色素瘤的病程进展。对移植黑色素瘤细胞小鼠的实验研究发现，黑色素瘤细胞的自噬水平越高，移植组织的致瘤性和侵袭性越强，而抑制自噬则可提高黑色素瘤细胞对治疗的敏感性，使黑色素瘤细胞重新发生凋亡[21]。

2.4细胞自噬可促进黑色素瘤细胞的转移 黑色素瘤中存在自噬，且自噬在黑色素瘤的转移及发展中起重要作用[17]。当自噬发生时，胞质分散型微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)-Ⅰ会转化为膜结合型LC3-Ⅱ，因此LC3常作为检测自噬活性的标志蛋白，其相对表达量可大致反映自噬水平。Lazova等[22]对皮肤组织进行免疫组织化学染色并观察自噬标志物LC3抗体的实验显示，正常皮肤组织中黑色素细胞内染色不明显，而只发生皮肤播散型黑色素瘤组织细胞的LC3抗体染色明显。此外，氯喹作为一种溶酶体药物和自噬抑制剂作用于黑色素瘤细胞，可诱导自发性黑色素瘤细胞死亡并减少转移性黑色素瘤细胞的克隆增殖[15]。

3 PI3K/Akt/mTOR信号通路与黑色素瘤耐药的相关性

PI3K/Akt/mTOR信号通路广泛参与调控细胞增殖、凋亡以及细胞周期等生理病理活动，该通路的失调与黑色素瘤的发生发展密切相关[23]。PI3K/Akt/mTOR信号通路可通过减少黑色素瘤细胞中凋亡发生的程序触发另一种细胞生存途径，使黑色素瘤对BRAF抑制剂产生耐药。因此，深入探讨PI3K/Akt/mTOR信号通路有助于全面了解黑色素瘤耐药的原因。

3.1PI3K/Akt/mTOR信号通路

3.1.1PI3K PI3K是一种脂质激酶，广泛分布于多种哺乳动物的细胞质中，并作为PI3K/Akt/mTOR信号通路的起始因子以及传递细胞间信息和调节胞质内囊泡运输的信使[24]。目前已发现3种不同类别的PI3K，根据作用底物不同可将其划分为 3个亚型[25]：PI3KⅠ、PI3KⅡ、PI3KⅢ。PI3KⅠ是由两种不同亚基(p110催化亚基、p85调节亚基)所构成的异源二聚体，其在细胞内较为活跃，可将膜结合的磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸转化成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸。磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸被认为是触发募集和激活激酶的二级信使，其受到人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因的调节而发生去磷酸化，导致磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸活跃持续时间减少。PI3KⅡ和PI3KⅢ可调节细胞内物质循环和自噬途径中的膜运输[26-27]，间接影响细胞信号转导。

3.1.2Akt Akt是由反转录病毒安基因V-Akt基因编码的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也是PI3K下游离子靶向电位调节中的关键分子之一，在细胞存活和凋亡中起重要作用。当Akt的T308和S473残基被磷酸化时，Akt被完全激活。活化的Akt可以磷酸化多种酶，包括胱天蛋白酶9等[28]。目前已发现3种Akt家族成员[Akt1、Akt2、Akt3(又称PKBα、PKBβ、PKBγ)]均参与下游底物的活化过程，但在不同的细胞环境中，上述Akt家族成员的功能存在差异[29-30]。Akt1广泛分布于组织细胞中，可调控细胞增殖和生长，参与包括细胞凋亡和葡萄糖代谢在内的细胞过程。Akt2主要分布在肌肉和脂肪细胞中，在人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因功能缺失的前列腺癌细胞中发挥作用。Akt3在大脑和睾丸中表达较多，参与细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤形成、糖原合成和葡萄糖摄取等生物学过程。

3.1.3mTOR mTOR是PI3K/Akt的下游激酶，属于PI3K相关激酶家族成员之一。mTOR是PI3K/Akt/mTOR信号通路的免疫调节物质及能量代谢控制中心[31]。mTOR可分为mTOR复合物(mTOR complex，mTORC)1和mTORC2两种类型，其中mTORC1在PI3K/Akt/mTOR信号通路中发挥主要作用。mTORC1对雷帕霉素的敏感性高，而mTORC2对雷帕霉素不敏感。mTORC1受激素、生长因子、营养物质和细胞应激等各种环境信号所调节，通过增加蛋白质的生物合成来影响细胞的生长和存活。此外，mTORC1还参与了细胞骨架组织的调节，可通过Akt的磷酸化和激活在细胞增殖的调节中发挥作用，但mTORC2的确切作用尚不完全明确[25]。当营养丰富时，mTOR信号被激活，蛋白合成增加，细胞体积增加；当营养不足时，mTOR信号被抑制，能量消耗和蛋白合成减少[32]。

3.2PI3K/Akt/mTOR信号通路可调节细胞自噬 自噬产生的调节机制非常复杂。mTOR是多条调节细胞自噬信号通路的重要聚合点，是产生自噬过程的核心因素，可负性调节自噬的发生[32-33]。在mTOR上游主要有两条信号通路具有激活mTOR的作用，即PI3K/Akt信号通路和Raf/促分裂原活化的蛋白激酶激酶/胞外信号调节激酶信号通路。细胞自噬主要受PI3K/Akt信号通路的调节[19]。PI3K是mTOR的上游激活剂，通过磷酸化下游重要的信号转导分子Akt调控mTOR，mTOR可通过Akt直接或间接磷酸化而被激活，磷酸化后被激活的mTOR可抑制自噬的发生[34-35]。mTOR可通过多种途径影响自噬途径[36]：①通过增强4E结合蛋白-1的磷酸化，使其与真核细胞翻译起始因子4E分离，从而抑制自噬。②从Unc-51样激酶1复合物上解离的mTOR通过防止Unc-51样激酶1的外源活化，促进Unc-51样激酶1自身活化FIP200和自噬相关蛋白13，减少自噬泡形成，进而抑制自噬。③死亡相关蛋白1作为mTOR的作用底物，可抑制自噬。④mTOR可通过调控Ambra1(autophagy/Beclin 1 regulator 1)的磷酸化抑制自噬的活性。

3.3PI3K/Akt/mTOR信号通路在黑色素瘤耐药性中的作用 抑制自噬上游负性调控的PI3K/Akt/mTOR信号通路后，黑色素瘤细胞内的自噬水平明显升高，黑色素瘤细胞凋亡明显减弱，黑色素瘤细胞对药物抵抗性明显增强[37]。在BRAF抑制剂治疗早期，BRAF突变黑色素瘤细胞对药物治疗反应良好，肿瘤细胞的生长、增殖、分化受到抑制，瘤体有所缩小，患者状态有所改善，但大部分患者于治疗约6个月时出现耐药[38-39]。细胞内的PI3K/Akt/mTOR信号通路负性调节细胞自噬，故推测，在BRAF抑制剂治疗一段时间后，由于黑色素瘤细胞内PI3K/Akt/mTOR信号通路长期受到影响，其持续的低水平表达可能促进了细胞自噬水平的上调蓄积，而黑色素瘤细胞通过这种“诱导”自噬获取了较多的胞内营养支持，使其对基因靶向药物的耐受性增加，抗细胞凋亡能力增强，导致黑色素瘤耐药性的发生。

4 小 结

黑色素瘤恶性程度高，可选择的治疗方法有限，且黑色素瘤细胞广泛的耐药性导致治疗效果欠佳，患者生存率较低。因此，亟须更好地了解黑色素瘤细胞产生耐药性的分子机制，以促进黑色素瘤治疗的进展。黑色素瘤细胞产生耐药性的分子机制目前尚不完全明确。黑色素瘤对基因靶向药物BRAF抑制剂产生耐药可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路及细胞自噬相关，随着研究的不断深入，对黑色素瘤产生耐药性的分子机制的认识将逐渐明确，这将为未来黑色素瘤的治疗提供很大帮助。