m6A在前列腺癌中的作用研究进展

张宏宇，张宇曦，孔垂泽

(中国医科大学附属第一医院泌尿外科，辽宁沈阳 110001)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一，在全球恶性肿瘤死因排行榜中位列第5[1]，是美国男性恶性肿瘤的第2大死亡原因[2]。在亚洲国家，PCa患者的数量也呈逐年上升的趋势，并有研究发现，PCa的患病风险可能与人口老龄化有关[3]。N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)是RNA的一种修饰形式，参与PCa的发生发展过程。但m6A甲基化修饰在PCa中的作用机制尚不明确，因此本文就m6A与PCa的最新研究进展作一综述。

1 m6A的概述

随着科学技术的进步，现已发现了170多种RNA修饰形式[4]。其中m6A是真核生物中最常见的在腺苷酸第6位氮原子上发生的RNA修饰形式[5]，常见于信使RNA(mRNA)中[6]。m6A修饰常发生在RRACH(R=A/G,H=A/C/U)的特定序列中，主要出现在3′端非翻译区(3′UTR)的终止密码子附近和长的外显子内[7]。m6A修饰由甲基转移酶催化，被甲基化结合蛋白识别，通过去甲基化酶去除修饰，是一个动态可逆的过程[5-6，8]。m6A修饰在RNA代谢的许多方面发挥着重要作用，影响mRNA的剪切、转运、翻译和稳定性，并参与各种生物过程[5，8]。

2 调控m6A甲基化修饰的机制

2.1 甲基转移酶m6A甲基化修饰过程是由甲基转移酶复合物催化的[9]，甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase-like 3，METTL3)、甲基转移酶样蛋白14(methyltransferase-like 14，METTL14)和Wilms肿瘤1相关蛋白(Wilm’s tumor 1-associated protein，WTAP)是组成甲基转移酶复合物的核心部分[10-11]。METTL3作为催化单元与METTL14紧密结合形成稳定的异二聚体[9]，催化甲基转移到腺苷上[12]。WTAP起桥梁作用，结合甲基转移酶形成复合物[13]，使甲基基团进入RNA[8]，完成m6A甲基化过程。随着研究的深入，甲基转移酶样蛋白16、病毒样m6A甲基转移酶相关蛋白(virlike m6A methyltransferase associated protein，VIRMA)、RNA 结合基序蛋白15、RNA 结合基序蛋白15B、锌指CCCH域蛋白13、Cbl原癌基因E3泛素连接酶蛋白类似物1等甲基转移酶蛋白被发现参与m6A的修饰过程[8-9，14-18]。转录因子锌指蛋白217也参与甲基转移酶复合物活性的调控[9]。

2.2 去甲基化酶去甲基化酶在去除m6A RNA上的甲基基团过程中发挥作用，脂肪和肥胖相关蛋白(fat-mass and obesity associated protein，FTO)和ALKB同系物5(AlkB homolog 5，ALKBH5)是最常见的去甲基化酶[19-21]。FTO以m6A修饰的rRNA为底物，且对含有3-甲基尿嘧啶(3-meU)的单链RNA尤为敏感[22]，而ALKBH5主要催化去除mRNA的m6A修饰[23]。最近的一项研究发现另一种去甲基化酶——ALKB同系物3(AlkB homolog 3，ALKBH3)，不同于上述2种去甲基化酶，它主要对tRNA中的m6A位点发挥去甲基化酶的活性，而对mRNA和rRNA的敏感性较差[21]。

2.3 甲基化结合蛋白甲基化结合蛋白识别m6A修饰位点并与之结合发挥特定作用。我们最早发现的甲基化结合蛋白是YTH结构域家族蛋白，包括YTHDF1(YTH domain-containing family protein 1)、YTHDF2(YTH domain-containing family protein 2)、YTHDF3(YTH domain-containing family protein 3)、YTHDC1(YTH domain-containing protein 1)和YTHDC2(YTH domain-containing protein 2)[24-25]，它们通过自身的“疏水口袋”和“芳香结构”结合含有m6A的RNA[9]。YTHDF亚型蛋白与mRNA中的所有m6A位点结合，而YTHDC1则结合mRNA中的某些m6A位点以及核非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)中的m6A位点，YTHDC2则与少数特定的m6A位点相结合，尤其是在ncRNA中[24]。当前的研究证明，YTHDF亚型的蛋白主要位于细胞质中[8]，而YTHDC亚型的蛋白主要在细胞核中发挥作用。YTHDF1能够提高mRNA的翻译效率[26]，YTHDF2则通过破坏mRNA的稳定性促进mRNA的降解[27]，而YTHDF3与YTHDF1和YTHDF2相互作用分别促进mRNA的翻译和衰变。YTHDC1能够调控mRNA的表达水平，也可以影响mRNA的转运[8-9]。YTHDC2蛋白在细胞核内外均可存在，可以选择性地与ncRNA的m6A位点结合提高转移相关因子HIF1α的表达[24]。随着研究的深入，胰岛素样生长因子2结合蛋白(Insulin-like growth factor 2 binding protein,IGF2BP)、真核起始因子3、不均一核糖核蛋白A2B1和不均一核糖核蛋白C作为甲基化结合蛋白也陆续被发现[28]。

3 m6A甲基化修饰和PCa的关系

3.1 METTL3与PCa的关系通过对TCGA和GEPIA数据库的研究分析，CAI[29]等发现，在人PCa细胞系(LNCaP、PC3、C4-2、C4-2B和DU-145)中，METTL3蛋白和m6A水平高于正常人前列腺上皮细胞(RWPE-1)。将METTL3基因敲除后能够发现LNCaP和PC3细胞的增殖和存活被明显抑制，同时其集落形成能力和侵袭性也受到明显抑制。这些结果表明降低METTL3水平能够抑制PCa细胞的增殖、存活、集落形成和侵袭，并且m6A水平也受到明显抑制。过表达METTL3时，m6A水平和PCa细胞的作用出现一致的变化，表明METTL3对PCa细胞的作用依赖于m6A的催化活性。通过体内实验发现METTL3能够调节肿瘤的生长。进一步研究发现，当METTL3耗尽后，GLI1(SHH-GLI信号通路重要组成部分)的表达水平下降，Sonic Hedgehog(SHH)信号通路下游靶点(如c-myc、cyclin D1)的mRNA水平受到明显抑制，Bak和Bax(促凋亡)蛋白水平、PARP cleavage、caspase 3/7活性均升高，Bcl-2和Bcl-xL(抗凋亡)蛋白水平下降。这表明METTL3通过SHH-GLI信号通路调控PCa细胞凋亡。而且，SHH-GLI信号通路的激活与PCa的严重程度呈正相关，SHH-GLI信号通路的活性与耐药性之间也存在一定的相关性。

有研究表明，METTL3通过增加MYC(c-myc) mRNA的m6A水平来增强MYC的表达，从而导致PCa的发生发展。过表达野生型METTL3可以显著增加MYC蛋白的表达，而当催化突变型METTL3过表达时，甲基化的MYC mRNA水平不受影响，说明过表达催化突变型METTL3并不能促进细胞的增殖和PCa的进展，提示METTL3在PCa中的致癌作用依赖其甲基转移酶的催化活性。分析显示，MYC和METTL3蛋白水平呈正相关，METTL3高表达的样本中MYC水平也较高，反之亦然。MYC过表达能够挽救METTL3基因敲除对PCa细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，这些发现表明原癌基因MYC是METTL3介导m6A修饰调控的下游功能靶点[30]。

MA[31]等研究发现，淋巴样增强结合因子1(lymphoid enhancer-binding factor 1，LEF1)在PCa组织中的表达也出现明显上调，METTL3通过LEF1 mRNA m6A甲基化来调节LEF1的蛋白水平。IGF2BP2与m6A修饰的LEF1 mRNA结合，延长LEF1 mRNA的半衰期，提高LEF1蛋白水平。METTL3通过m6A修饰的LEF1激活Wnt通路。LEF1/TCF蛋白与β-catenin相互作用激活Wnt通路及其下游基因，并通过激活Wnt通路来刺激细胞增殖和抑制分化。METTL3的敲除能够降低Wnt通路的活性，但LEF1过表达可以部分逆转因METTL3基因敲除而导致的Wnt通路活性下降。总的来说，METTL3通过m6A甲基化作用于LEF1 mRNA，影响Wnt/β-catenin通路的活性，进而促进PCa的进展。

最近的研究发现，在PCa组织中METTL3蛋白的表达明显高于癌旁组织，并且在伴有骨转移的PCa中表达最高。METTL3可能通过依赖m6A的方式调节整合素β1(integrin β1，ITGB1)、mRNA的稳定性和/或翻译来调控ITGB1蛋白的表达，进而促进PCa细胞向Ⅰ型胶原的募集。此外，METTL3的过表达促进了PCa细胞在富含胶原的环境中的存活和增殖，而其表达下调抑制了PCa细胞的增殖[32]。

综上所述，针对SHH-GLI信号通路、MYC下游功能靶点、Wnt/β-catenin通路等相关靶点的治疗方法，可能为PCa的治疗提供新的方向。

3.2 FTO与PCa的关系有关基因多态性研究提示，FTO基因的多态性(SNPs)rs9930506和rs9939609与肥胖和PCa相关。FTO基因区SNP rs9930506与体重指数(body mass index,BMI)和肥胖相关，而肥胖与PCa侵袭性和死亡率的增加有关。突变的rs9939609与患PCa的风险呈负相关，与超重呈正相关，但在超重的病例中，rs9939609突变的患者患严重PCa的几率更高。分析rs9939609与PCa风险和严重性之间的关系发现，拥有至少一个“A”等位基因可以降低PCa风险和严重程度。在动物实验中，过表达FTO会增加胚胎成纤维细胞中RUNX1T1转录因子的表达，刺激脂肪细胞的数量导致肥胖，同时升高PCa的患病风险[33-34]。

3.3 YTHDF2与PCa的关系另一项研究发现，与正常前列腺上皮细胞和组织相比，YTHDF2在人PCa细胞系(DU-145和PC3)和组织中高表达。YTHDF2通过结合m6A位点，使mRNA降解，从而降低mRNA m6A的整体水平，进而促进PCa的增殖和转移。当YTHDF2基因被敲除后，发现m6A的整体水平升高，并且PCa的增殖和转移能力受到明显抑制。这表明YTHDF2以依赖m6A的方式参与了PCa的发展进程。miR-493-3p作为YTHDF2的直接上游因子，与YTHDF2表现出相反的作用，过表达miR-493-3p通过3′UTR抑制了YTHDF2的翻译，使m6A水平上调，从而抑制PCa的增殖转移。二者均参与了PCa中m6A的修饰，并以m6A的方式间接调控PCa的进展。这说明YTHDF2和miR-493-3p作为2个关键的m6A调控因子在调节PCa的过程中发挥重要作用[35]，可能成为PCa治疗的一个潜在方向。

4 总结与展望

m6A甲基化修饰是由甲基转移酶、去甲基化酶和甲基化结合蛋白共同作用完成的一种RNA修饰形式，参与RNA代谢、肿瘤发生发展等多种生物过程。在PCa中，METTL3蛋白以m6A依赖的方式促进PCa细胞的增殖、存活、集落形成和侵袭能力，通过增强MYC的表达和Wnt通路的激活促进PCa的发生发展，并通过SHH-GLI信号通路调控PCa细胞的凋亡。YTHDF2蛋白作为m6A的调控因子，以依赖m6A的方式促进了PCa的发展。VIRMA和YTHDF3蛋白在晚期PCa患者中也出现明显表达。因此，针对m6A甲基化修饰及其相关蛋白为靶点的治疗方法可能成为PCa治疗的一个潜在的新方向，所以需要进一步去明确m6A甲基化修饰及其相关蛋白在PCa中的作用机制，以发现更有效的治疗方法。