高迁移率族蛋白B1在结直肠癌中的机制研究

赵威威，原娜，陈安祺，张贤雨，卢秀荣，张志林

(1.河北北方学院研究生学院，河北 张家口 075000； 2.河北北方学院附属第一医院放射治疗科，河北 张家口 075000)

随着人们生活水平及生活质量的提高，结直肠癌(colorectal cancer，CRC)已成为危害我国人民生命健康的主要恶性肿瘤之一，由于CRC患者早期症状不明显,就诊时有一半以上的患者已经发生远处转移。近年对CRC发病机制的深入研究证实，高迁移率族蛋白(high mobility group，HMG)B1与CRC发生发展密切相关[1]。CRC组织中HMGB1的表达明显升高，而HMGB1表达直接参与CRC的浸润和迁移过程，且HMGB1表达水平越高，CRC分期越晚。HMGB1是HMG家族的最重要成员，在细胞核内具有高度保守性，主要参与DNA修复、转录和基因组稳定，在细胞核外表观遗传后具有促进炎症、免疫、细胞增殖、自噬、凋亡和转移的作用[2]。体外研究表明，结肠癌LoVo细胞中受翻译调节的肿瘤蛋白过表达可导致HMGB1从细胞核释放到细胞质并进入细胞外空间，通过结合Toll样受体(Toll like receptor，TLR)/晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end product，RAGE)而激活核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)通路，进而促进LoVo细胞的侵袭和转移；同时体内实验证实，受翻译调节的肿瘤蛋白在裸鼠内过表达可增强肿瘤组织中HMGB1的表达，并激活NF-κB信号通路中的关键蛋白[3]。另外，肿瘤细胞释放的HMGB1也可通过结合TLR4激活NF-κB信号通路促使白细胞介素(interleukin，IL)-6和肿瘤坏死因子-α分泌，诱导肿瘤发生[4]。早期研究发现，CRC分泌的HMGB1可诱导肿瘤微环境中巨噬细胞凋亡，从而抑制宿主的抗癌免疫系统，且临床研究证实，HMGB1水平与巨噬细胞数量呈负相关[5]。另有文献报道，HMGB1向胞外释放增加可抑制放疗的抗肿瘤作用[6]。现就HMGB1在CRC发生发展中的研究进展予以综述，以期为CRC的临床诊疗提供理论依据。

1 HMGB1概述

HMGB1是一种位于细胞核内的多功能非组蛋白，包含两个结合位点(N端A和中央B)以及一个酸性C端尾巴，这种结构对稳定染色体、维持端粒酶和修复DNA功能起关键作用[1]。HMGB1是一种损伤相关分子模式分子，在细胞损伤、感染和炎症过程中，其从细胞核转运到细胞质，最终分泌到细胞外[7]。在细胞外，HMGB1以3种互斥的氧化还原状态存在，分别为全硫醇HMGB1(完全还原)、二硫键HMGB1(半氧化)、末端氧化的HMBG1。全硫醇HMGB1具有促使免疫细胞向炎症部位浸润的作用；二硫键HMGB1具有诱导细胞因子活化的作用，触发各种细胞因子从邻近细胞释放，参与炎症反应的全过程；而末端氧化的HMGB1可抑制炎症反应[8]。因此，HMGB1可能因其不同氧化还原状态在不同疾病的发病机制中发挥不同的作用。HMGB1的主要受体是TLR和RAGE，两种受体的信号通路不同，但发生应激反应时，两者最终均可促使NF-κB磷酸化，并可被蛋白酶降解，从而导致细胞增殖、炎症，甚至诱发肿瘤和促进肿瘤转移相关靶基因的激活[2]。

2 HMGB1促进CRC发生、发展

2.1HMGB1促进CRC的基因改变 CRC的发生发展是多步骤的涉及多基因改变的复杂过程。肿瘤抑制基因腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposiscoli，APC)基因突变被认为是CRC中常见的早期突变[9]。APC基因是Wnt信号的关键调节剂，在调节肠内稳态中发挥至关重要的作用。在APC基因功能丧失后，一方面，肠上皮细胞内Wnt信号激活，导致HMGB1的主动分泌，且血清HMGB1水平显著提高，诱导CRC细胞增殖、迁移；另一方面，HMGB1信号可能通过RAGE释放并促进炎症激活，进而对正常肠道稳态和干细胞进行反馈调节，导致CRC的发生发展。在中和抗HMGB1抗体后，APC基因丧失相关“缺氧”区域的程度明显降低，随之CRC的疗效有所提高。

Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因是一种原癌基因，在CRC的发展和治疗中起重要作用，其中30%～45%的Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因的12或13位密码子表达发生突变；Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因主要激活Raf-促分裂原活化的蛋白激酶级联反应，最终导致促分裂原活化的蛋白激酶底物磷酸化和致癌转录因子激活，从而驱动癌细胞的增殖、侵袭和化学耐药性[10]。研究发现，HMGB1-RAGE可能以Yes相关蛋白依赖的方式触发Wnt/β联蛋白信号，通过上调结肠癌HCT-116和SW480细胞中CD44和Sox2的表达促进CRC进展，而应用HMGB1抗体后，结肠癌细胞的增殖明显受到抑制[11]，故可通过HMGB1探索CRC基因改变的机制。

2.2HMGB1促进CRC的增殖和转移 CRC浸润和转移是导致肿瘤相关死亡的主要原因。HMGB1在促进CRC细胞增殖、侵袭和迁移中起重要作用。有研究表明，沉默HMGB1表达可显著抑制CRC细胞增殖、侵袭和迁移[12]。一方面，可能与JAK/信号转导及转录活化因子3通路的激活有关；另一方面，可能与RAGE信号通路相关的蛋白质产生及其磷酸化有关。当裂解的胱天蛋白酶3和增殖细胞核抗原表达增加时，HMGB1的表达也相应增加[13]。另外，HMGB1合成的反义寡脱氧核苷酸也减少了胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2、Rac1和蛋白激酶B的磷酸化以及诱导型一氧化氮合酶、NF-κB p65和基质金属蛋白酶9的产生。因此，HMGB1-RAGE轴可作为抗CRC治疗的靶标[14]。综上，HMGB1可能通过多种途径促进CRC细胞增殖和迁移，同时上述途径也可增强HMGB1的作用，可能是抑制CRC转移的一种方法。

2.3HMGB1诱导CRC的自噬 自噬是一种自我消化机制，可通过消除溶酶体降解受损的细胞器和蛋白质聚集体来促进细胞存活。研究发现，HMGB1可在转录水平上调节自噬，且自噬也可能诱导HMGB1的分泌[15]。HMGB1通过诱导CRC自噬并促进其细胞存活，即微管相关蛋白1轻链3和Beclin1，促进B细胞淋巴瘤/白血病-2的磷酸化，进而抑制CRC细胞的凋亡。一方面，可能与促分裂原活化的蛋白激酶激酶/ERK信号转导通路激活导致的化学性耐药有关；另一方面，可能与c-Jun氨基端激酶通路的激活，从而促进内质网应激诱导的自噬，抑制细胞凋亡有关[16]。此外，氧化氢和超氧化物歧化酶1介导的氧化应激可促进细胞质中HMGB1的表达，并促进其在细胞外释放。在氧化应激条件下，HMGB1是存在氧化应激的自噬传感器，可反馈地抑制HMGB1释放，进而减少人和小鼠细胞系中自溶酶体和自噬通量的数量[17]。肠上皮 HMGB1可直接参与抑制信号转导及转录活化因子3的活化、保护肠道免受细菌感染和其他物质的损伤。当沙门菌感染肠上皮细胞缺乏HMGB1时，信号转导及转录活化因子3重新分布，自噬减少[18]。有证据表明，肿瘤微环境中CRC自噬的增加可加速肿瘤的侵袭，且结肠癌Lewis细胞自分泌的HMGB1与RAGE结合可激活ERK1/2信号通路，促进肿瘤细胞自噬，并抑制其发生细胞凋亡[15]。由此可见，HMGB1导致的自噬可通过限制肿瘤细胞的坏死和炎症反应增加CRC细胞的损伤，进而发挥促瘤作用[16]。自噬是导致实体瘤转移和生长的潜在危险因素，故调控自噬中HMGB1的作用可能成为治疗CRC的新方法。

2.4HMGB1促进CRC的能量代谢 正常细胞主要以糖酵解和氧化代谢方式供应能量，而癌细胞主要以无氧糖酵解方式满足能量需求，这可能通过微管相关蛋白1轻链3、Beclin1的激活以及其他细胞的自噬实现[17]。在无氧糖酵解过程中，肿瘤细胞可促进肌肉细胞中 HMGB1的表达，其通过识别肌肉细胞RAGE介导丙酮酸激酶的失活，不利于肌肉细胞的能量代谢。另外，由于缺乏糖酵解产生的乙酰辅酶A，HMGB1增加了肌肉细胞内谷氨酰胺的摄取，体内研究发现，肿瘤细胞分泌的HMGB1可将谷氨酰胺整合到乙酰辅酶A中，并诱导肌肉细胞将谷氨酰胺转移至癌细胞[19]，表明HMGB1可通过谷氨酰胺途径为肿瘤细胞提供能量，这可能是抑制肿瘤细胞进展的策略之一。

3 HMGB1参与CRC的侵袭和转移

3.1HMGB1诱导CRC的上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT) EMT在肿瘤进展早期阶段的肿瘤细胞侵袭和转移中起着不可或缺的作用[20]。一方面，HMGB1可能通过RAGE依赖性激活来诱导EMT，参与CRC细胞的迁移。HMGB1与RAGE的相互作用可导致各种蛋白质(Snail蛋白、NF-κB和基质金属蛋白酶7)上调，而这些蛋白质是EMT启动的开关[21]。在肿瘤微环境中，癌细胞能够诱导基质细胞(如成纤维细胞)的活化，活化的成纤维细胞可分泌生长因子和各种基质金属蛋白酶[22]，进而影响细胞-细胞和细胞-细胞外基质的“交流”，最终促进CRC细胞的迁移[23]。另一方面，CRC细胞释放的HMGB1可通过激活TLR4诱导成纤维细胞活化，与HMGB1触发磷脂酰肌醇-3-激酶和促分裂原活化的蛋白激酶通路的激活有关[24]。因此，进一步评估HMGB1结合RAGE和TLR4的方式及其影响因素有助于更好地认识HMGB1在CRC侵袭和转移中的作用。

3.2HMGB1促进CRC的血管生成 HMGB1的高表达参与肿瘤的血管生成，而血管形成可为肿瘤的生长和转移提供营养支持[25]。HMGB1可以激活促血管生成信号，促进CRC的血管形成，也可通过自分泌和旁分泌的反馈机制上调其受体RAGE和TLR4的表达，进而导致血管内皮细胞迁移[26]。临床研究发现，与正常结肠内皮细胞相比，CRC患者结肠内皮细胞HMGB1水平明显升高，其原因可能为：①HMGB1通过激活NF-κB诱导血管内皮细胞中各种促血管生成基因的表达，包括整合素、基质金属蛋白酶、E选择素和促炎性白细胞黏附分子(如血管细胞黏附分子1和细胞间黏附分子1)，其中E选择素可促进ERK1/2和p38的磷酸化，进而介导CRC细胞的转移，同时磷酸化的ERK1/2和p38可进一步增强HMGB1的分泌[27]。②HMGB1可释放血管内皮生长因子A，并上调血管内皮生长因子受体1和2、神经纤毛蛋白1的表达，诱导CRC的血管生成[26]。③HMGB1也可刺激血小板衍生生长因子的表达，后者参与新生血管的生长和发育[28]。此外，HMGB1还可促进CRC淋巴内皮细胞的形成。CRC患者HMGB1的高表达不仅与血管内皮生长因子C有关，还与淋巴微血管密度显著相关，其机制可能是HMGB1通过激活NF-κB上调血管内皮生长因子C，从而影响淋巴管的浸润[29]。体内外实验证实，HMGB1中和抗体可显著抑制CRC新生血管的形成，RAGE抑制剂也可抑制HMGB1诱导的促血管生成[26]。因此，可通过靶向HMGB1抑制肿瘤细胞与内皮细胞之间的血管生成，进而抑制CRC血管生成。

4 HMGB1与CRC的免疫反应

HMGB1具有抑制宿主免疫系统的作用，在协调免疫和炎症反应中起关键作用。近年研究发现，HMGB1参与肿瘤浸润淋巴细胞、调节性T细胞、髓源性抑制细胞的形成[6]，并通过与RAGE和TLR4相互作用激活多条信号转导通路，导致各种促炎介质的产生以及固有免疫反应的激活。HMGB1通过激活RAGE/TLR4增强磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路的传导，从而破坏调节性T细胞的稳定性[30]。调节性T细胞作为防止免疫系统攻击自体器官的免疫耐受细胞，可抑制CD8+T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和抗原呈递细胞的活化及增殖，并释放IL-10抑制性细胞因子，进而促进肿瘤生长[31]。此外，HMGB1通过诱导调节性T细胞产生IL-10来抑制CD8+T细胞的抗肿瘤作用，导致CRC的局部浸润和扩展[32]。另外，CRC细胞中的HMGB1具有通过结合TLR4诱导单核细胞分泌肿瘤坏死因子-α的能力。HMGB1可通过激活RAGE诱导 NF-κB活化，从而提高癌细胞的存活率[33]。免疫系统可感知肿瘤并募集和激活肿瘤抗原特异性CD8+T细胞，从而抑制肿瘤生长，CD8+T细胞作为肿瘤浸润淋巴细胞，参与适应性免疫应答，是抗肿瘤免疫的主要作用因子[31]。有研究发现，HMGB1通过抑制树突状细胞将肿瘤抗原呈递给T细胞，从而导致肿瘤逃逸，这不仅与树突状细胞的c-Jun氨基端激酶磷酸化显著减少有关，还与胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9 的增多有关[34]。另外，HMGB1可通过调节中性粒细胞的活化和自噬促进多形核髓系抑制细胞产生，髓源性抑制细胞不仅可诱导肿瘤血管生成，还可重塑肿瘤微环境[35]。研究发现，肿瘤分泌的HMGB1以剂量依赖的方式诱导库普弗细胞凋亡[36]。另一项研究发现，CRC中浸润的细胞毒性T淋巴细胞高表达与肿瘤低复发率和良好预后有关[37]。故认为，HMGB1可通过抑制或减弱先天性和适应性宿主免疫抑制癌细胞进展。

然而，HMGB1也具有增强免疫反应的作用，其可能与免疫球蛋白的增强有关。实验研究发现，HMGB1具有诱导树突状细胞激活和成熟的能力，通过识别树突状细胞实现抗原呈递，进而促进效应T细胞的分化和增殖，增强抗瘤作用[38]。HMGB1通过诱导嗜酸粒细胞脱颗粒增强免疫反应[39]。自然杀伤细胞分泌的HMGB1通过引发代谢性细胞死亡诱导CRC细胞死亡，这与其抑制焦磷酸丙酮酸激酶作用有关[40]，不利于肿瘤细胞的能量代谢。

CRC细胞表达的HMGB1具有趋化白细胞的作用。经HMGB1处理的小鼠巨噬细胞可激活B细胞的NF-κB，进而诱导IL-6、IL-12、CC趋化因子配体5、CC趋化因子配体19、CC趋化因子配体20、粒细胞集落刺激因子和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的聚集，参与肿瘤的进展[41]。HMGB1在调控肿瘤的免疫反应中具有双重作用，对其进行深入研究有助于抑制其促癌特性，并保持其抗癌特性。

5 小 结

HMGB1主要通过RAGE/TLR直接作用于肿瘤细胞，加速基因突变，影响代谢及自噬，促进肿瘤细胞的增殖、浸润、迁移；或通过间接促进肿瘤的EMT、血管形成及肿瘤免疫微环境影响CRC的发生发展，上述机制涉及多种信号通路的激活或失活以及促炎因子的释放和固有免疫细胞的抑制，甚至诱发抑制性免疫细胞并导致肿瘤逃逸。将基于HMGB1中和抗体的实验研究以及人源化抗HMGB1单克隆抗体用于CRC发生发展机制的研究和实践，可能是治疗CRC的一种可行方法。