间充质干细胞来源的外泌体治疗慢性创面研究进展

李岱洛，付海亮

(哈尔滨医科大学附属第二医院骨外科，哈尔滨 150086)

皮肤伤口愈合的过程复杂。受伤会引发一系列重叠的事件：①止血；②炎症反应；③组织的形成/细胞增殖；④组织重塑、成熟[1]。糖尿病、感染、静脉淤滞会使伤口愈合过程出现异常，具体表现为伤口出现过度炎症反应、成纤维细胞迁移和增殖能力受损、胶原形成与沉积异常、再上皮化受阻等，最终导致伤口延迟愈合、瘢痕化和慢性创面的形成。慢性创面存在迁延不愈、治疗时间长、治疗难度大、费用高、反复发作、致残率高等问题，使患者丧失正常的生活自理能力，给个人、家庭及社会造成沉重的负担[2]。外泌体作为间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)分泌的一种细胞外囊泡，在MSC参与组织修复过程中发挥重要作用。作为一种非细胞治疗手段，MSC来源的外泌体(MSC-derived exosomes,MSC-exo)的应用既可以避免干细胞移植所带来的免疫排斥反应和致癌风险[3]，又可以促进慢性创面的修复,为慢性创面治疗提供了一个新策略。现就MSC-exo治疗慢性创面的研究进展进行综述。

1 外泌体的概述

外泌体是细胞主动分泌的大小均一，直径为30～100 nm，密度为1.10～1.18 g/ml的囊泡样小体[4]。外泌体富含胆固醇和鞘磷脂，具有脂质双分子层结构，广泛存在于各种体液中，如尿液、唾液、血液[5]。提取和纯化外泌体主要依据其理化特性，具体方法包括超速离心法、蔗糖密度梯度离心法、超滤法、聚乙二醇沉淀法、色谱法、免疫磁珠法及试剂盒提取法等[6]。由于外泌体是由细胞分泌的一种含有多种调控细胞代谢因子的载体，可携带多种蛋白质、信使RNA、微RNA(microRNA，miRNA/miR)，参与细胞通信、细胞迁移、细胞免疫和肿瘤细胞生长等过程[7]。近年发现，外泌体具有修复肌肉损伤、软骨修复、促进骨再生等功能[8-10]。

2 MSC-exo治疗慢性创面的机制和应用

MSC-exo可以通过促进血管形成，加速皮肤细胞增殖和迁移，抑制过度炎症反应和瘢痕形成，促进慢性创面的愈合。

2.1促进血管形成 慢性创面，尤其是糖尿病溃疡部位常存在微血管病变，出现促血管生成因子的产生减少、内皮祖细胞减少等改变，最终造成血管网络的功能异常[11]。血管重建和血管生成是伤口愈合的重要表现。利用物理、化学和生物学方法预处理MSC是增强MSC-exo生物学活性，提高其再生修复功效的有效方法。Yu等[12]用瑞伐他汀对人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)进行预处理，之后分离提取阿托伐他汀预处理的人BMSC外泌体(BMSC-exosomes pretreated with atorvastatin,ATV-exo)。体外实验显示，ATV-exo在体外可促进内皮细胞的增殖、迁移和血管内皮生长因子的表达。体内实验显示，ATV-exo可加速链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠伤口愈合。结果表明，ATV-exo通过蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)/内皮型一氧化氮合酶信号通路上调miR-211-3p的表达，增强内皮细胞的血管生成，从而加速糖尿病大鼠的创面组织再生。另一方面，可以通过基因工程技术，将所需的目的基因导入MSC，进而获得携带有促进血管形成基因的外泌体。Zhang等[13]通过慢病毒转染获得过表达miR-126的BMSC，并从其中提取外泌体。定量反转录聚合酶链反应显示，转染miR-126模拟物的BMSC分泌的外泌体中miR-126表达水平显著升高。该外泌体在体外可增强人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的增殖、迁移和管状形成；而体内实验中可加速小鼠全厚皮肤伤口愈合。携带过表达miR-126的BMSC来源的外泌体通过下调磷脂酰肌醇-3-激酶调节亚基2激活磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt信号通路，从而促进HUVECs的血管生成。Liu等[14]经慢病毒转染，提取分离得到过表达促血管生成素-2的人脐带MSC-exo(human umbilical cord MSC-exo,HucMSC-exo)，其可促进HUVECs的增殖、迁移。将该外泌体注入大鼠深层Ⅱ度皮肤烧伤部位，加速了SD大鼠伤口愈合。水凝胶因具有生物相容性，可作为一种覆盖伤口的敷料。载有外泌体的水凝胶既能包裹创面，又能缓慢释放外泌体，协同促进慢性创面愈合。Nooshabadi等[15]制备了基于壳聚糖的水凝胶，该水凝胶富含来自人子宫内膜干细胞分离的外泌体。研究者使用全厚度切除伤口模型研究由壳聚糖、甘油和外泌体底物组成的水凝胶对伤口的作用，结果显示，用含有外泌体的壳聚糖支架覆盖可使近83.6%的伤口闭合，并可明显促进上皮再生。作为内皮细胞的标记，CD31在水凝胶-外泌体组中明显升高。壳聚糖-甘油-外泌体水凝胶可用于全厚度皮肤伤口替代和皮肤组织工程，促进伤口血管形成。Yang等[16]发现，HucMSC-exo结合聚丙二醇与环氧乙烷的聚合物(聚醚)水凝胶可以促进糖尿病慢性伤口愈合和皮肤再生。研究者将HucMSC-exo包裹在热敏Pluronic F127(一种聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯三嵌段共聚物)水凝胶中，应用于全厚度皮肤伤口。与HucMSC-exo、PF-127或对照组治疗相比，PF-127和HucMSC-exo联合治疗可显著加速创面愈合率，上调血管内皮生长因子的表达，促进肉芽组织再生。

2.2加速皮肤细胞增殖和迁移 成纤维细胞和角质形成细胞迁移和增殖是伤口愈合中重要的步骤之一。慢性非愈合伤口的成纤维细胞和角质形成细胞出现异常的表型，包括增殖减少、早期衰老和细胞因子释放模式的改变[17]。成纤维细胞和角质形成细胞对于正常的伤口愈合至关重要。在增殖阶段，它们分解血纤维蛋白凝块，产生新的细胞外基质和胶原蛋白，以支持与有效伤口愈合相关的其他细胞，收缩伤口。Ma等[18]研究发现，脂肪干细胞来源的外泌体(adipose stem cell-derived exosomes，ADSC-exo)可以促进HaCaT细胞(人永生化角质形成细胞)增殖和迁移，抑制过氧化氢引起的细胞凋亡，表明ADSC-exo在伤口愈合中具有积极作用，ADSC-exo通过激活Wnt/β联蛋白信号通路促进皮肤伤口愈合。Zhang等[19]构建了HaCaT细胞模型和小鼠伤口愈合模型，以检测ADSC-exo对伤口愈合的影响。细胞计数试剂盒-8检测和划痕实验表明，ADSC-exo可促进HaCaT细胞的增殖和迁移。蛋白质印迹法和实时聚合酶链反应显示，ADSC-exo可上调HaCaT细胞中Akt的磷酸化和缺氧诱导因子-1α的表达，抑制Akt磷酸化和降低缺氧诱导因子-1α表达，同时HaCaT细胞的迁移减慢。这些结果表明ADSC-exo可以促进HaCaT细胞增殖和迁移，从而促进伤口愈合。MSC-exo可能通过激活多种细胞信号通路，协同促进皮肤细胞的增殖和迁移。Gao等[20]将过表达miR-135a的人羊膜MSC-exo(human amniotic MSC-exo，hAMSC-exo)直接注射到伤口边缘，这促进了大鼠背部全厚皮肤缺陷的伤口愈合和伤口表皮化。体内实验显示，hAMSC-exo中的miR-135a通过下调大肿瘤抑制因子2促进人皮肤成纤维细胞的增殖和迁移。此外，敲除miR-135a可有效减少外泌体对细胞迁移的促进作用，这为hAMSC-exo miR-135a伤口愈合提供了依据。已有报道显示外泌体中存在长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)，表明lncRNA也可能载于MSC-exo中，通过介导细胞与细胞之间的沟通调节成纤维细胞中的基因表达[21]。Li等[22]发现将过表达lncRNA H19的MSC-exo注射进伤口边缘后，小鼠糖尿病足溃疡痊愈。体内实验结果显示，MSC-exo通过将lncRNA H19转入成纤维细胞，抑制miR-152-3p介导的人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten gene,PTEN基因)的抑制作用，继而激活磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt信号通路，调节成纤维细胞的增殖、迁移和凋亡，最终促进伤口愈合。

2.3抑制过度炎症反应 单核细胞和巨噬细胞被广泛认为是早期伤口炎症反应的原因，但其也有助于血管生成、伤口收缩和组织重塑。巨噬细胞分为2个主要亚群：M1型或促炎巨噬细胞和M2型或抗炎巨噬细胞。然而在糖尿病伤口中，从M1型到M2型的过度受损，这将导致这些伤口不会经过正常的愈合阶段，而是始终处于永久性的炎症阶段[23]。如何促进伤口巨噬细胞从M1型向M2型过渡，调节炎症反应，是促进伤口愈合的关键因素。He等[24]发现MSC-exo中的miR-223通过靶向pknox1基因调节巨噬细胞极化，进而调控伤口的炎症环境，促进皮肤伤口愈合。实验显示MSC-exo可促进大鼠皮肤伤口的愈合。流式细胞学分析和红色荧光标记染料PKH26染色发现巨噬细胞摄取MSC-exo、CD206、RELM-α(M2型巨噬细胞表面标志物)和白细胞介素-10表达增加，肿瘤坏死因子-α表达下降，提示MSC-exo促进巨噬细胞极化为M2型和抗炎因子的释放，并减少促炎因子的释放。Dalirfardouei等[25]发现经血的MSC-exo可促进糖尿病小鼠伤口愈合。在该研究中，诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)作为M1型巨噬细胞的一个重要标记，精氨酸酶作为M2型巨噬细胞的重要标记。为了评估巨噬细胞的极化，测定了iNOS和精氨酸酶的活性。在外泌体组中，与细胞组和对照组相比，iNOS活性显著降低，精氨酸酶活性显著增高，这说明经血的MSC-exo可以促进巨噬细胞从M1型转化为M2型。经药物或激素预处理的MSC成为研究热点，经过预处理的MSC-exo能抑制促炎因子的表达，增加抗炎因子的表达，调节慢性创面的炎症反应，促进慢性创面愈合。Liu 等[26]发现,褪黑激素刺激的MSC-exo(melatonin-stimulated MSC-exo，MT-Exo)可改善糖尿病伤口愈合。将MT-Exo与小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)进行共培养，发现MT-Exo降低了白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α和iNOS的相对基因表达，同时增加抗炎因子白细胞介素-10和Ⅰ型精氨酸酶的相对表达。通过流式细胞学分析发现，RAW264.7中M2型抗炎巨噬细胞的比例明显增加。在体内研究中，他们用链脲佐菌素建立了大鼠糖尿病伤口模型，MT-Exo通过靶向PTEN/Akt途径调控巨噬细胞M1型和M2型极化来抑制炎症反应，促进糖尿病大鼠的伤口愈合、体内血管生成和胶原蛋白合成。Ti等[27]发现脂多糖预处理后的HucMSC-exo可以将炎症人单核细胞系转化为M2型。具体机制可能是经脂多糖预处理后的外泌体通过将miR-let-7d转移到巨噬细胞中，激活Toll样受体4/核因子κB/信号转导及转录激活因子3/Akt信号通路，继而减少了大鼠糖尿病伤口的炎症反应，促进伤口的愈合。

2.4抑制瘢痕形成 肥厚性瘢痕通常发生于严重的烧伤损伤或慢性创伤，是一种纤维增生的皮肤伤口愈合障碍，表现为肌成纤维细胞活性增加，成纤维细胞减少，胶原蛋白异常沉积。肥厚性瘢痕可影响局部美观，导致功能障碍，极大影响患者的身心健康。因此在慢性创面的治疗中，如何避免肥厚性瘢痕的生成是一个难点。Fang等[28]研究表明，脐带来源的MSC-exo可通过减少肌成纤维细胞在创面的过度累积，从而抑制瘢痕形成。通过高通量转录组测序发现外泌体中富含miR-23a、miR-21等，该外泌体可阻断转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smad2信号通路，减少胶原沉积，抑制肌成纤维细胞的形成，从而抑制小鼠背部皮肤全层创面瘢痕的形成。Li等[29]发现ADSCs-exo可以抑制肥厚性瘢痕的成纤维细胞纤维化。体外实验结果显示，ADSCs-exo中的miR-192-5p靶向白细胞介素-17受体A/Smad信号通路，通过抑制白细胞介素-17受体A的表达和Smad2/3的磷酸化，下调α-平滑肌肌动蛋白、胶原蛋白Ⅰ型和胶原蛋白Ⅲ型的表达水平，最终起到抑制瘢痕形成的作用。TGF-β是属于一组调节细胞生长和分化的TGF-β超家族。TGF-β分子家族在瘢痕形成方面似乎发挥着核心作用，因为TGF-β1和TGF-β2亚型在瘢痕愈合的成人创伤中过表达，并且在没有瘢痕愈合的胚胎创伤中缺失或低水平表达。相反，TGF-β3亚型在没有瘢痕的伤口愈合中高表达。TGF-β3被认为可以预防和减少皮肤瘢痕[30]。Wang等[31]发现，人脂肪MSC-exo(human adipose MSC-exo，ASC-Exos)通过调节胶原蛋白Ⅰ型∶胶原蛋白Ⅲ型、TGF-β3∶TGF-β1和基质金属蛋白酶3∶组织金属蛋白酶抑制物1的比例，并通过抑制成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，促进皮肤伤口修复中的细胞外基质重建。具体表现为增加胶原蛋白Ⅲ型的比例，降低胶原蛋白Ⅰ型的比例，增加TGF-β3的比例，降低TGF-β1的比例，ASC-Exos激活了胞外信号调节激酶/促分裂原活化的蛋白激酶信号通路，并通过该途径提高了基质金属蛋白酶3的水平，最终重塑慢性创面基质，减少瘢痕的形成。MSC-exo通过减少肌成纤维细胞的形成、增加TGF-β3的表达等方式减少慢性创面瘢痕的产生，进而改善患者的生活质量。

3 小 结

MSC-exo参与慢性创面愈合的各个阶段。其具体作用是促进血管形成，加速皮肤细胞增殖和迁移，抑制过度炎症反应，抑制瘢痕形成。这些作用相互协同，共同促进创面恢复。随着对外泌体研究的深入，发现外泌体治疗具有安全性高、免疫原性低、可作为药物载体等优势。然而，外泌体的应用存在无法大规模制备、最佳提取，以及分离方式尚未确认、作用机制尚未阐明、容易降解等局限性。因此，开发一种低成本、高产量、高可重复性的外泌体提取方式将有利于外泌体研究。而认识和了解外泌体确切作用，掌握外泌体生成、剂量、体内分布和清除效率可为外泌体进一步临床应用提供安全性保障。通过药物、组织工程等预处理方式，提高外泌体的作用效率和靶向运输能力，降低外泌体的消除速率，从而增加外泌体的治疗效果。