中性粒细胞在结核病中作用的研究进展

林懿骞 张 敏

暨南大学附属广州红十字会医院呼吸内科，广东广州 510220

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，M.tuberculosis）引起，主要通过空气传播的一种传染病，目前是一个重要的全球健康问题。最新报告指出，2019年全球约有1/4的人口感染结核分枝杆菌，其中新增TB患者约有1000万例，死亡人数约为122万例，病死率仍然居于单一传染病首位[1]。结核分枝杆菌的感染取决于其与宿主多种免疫细胞的相互作用，其中，中性粒细胞是最早被募集到感染部位，也是肺部结核分枝杆菌感染时最多的免疫细胞，这已在多种TB模型中被证实[2]。近年来，很多研究发现，中性粒细胞在TB中不仅发挥着病原体的直接杀灭作用，也在分子调节及病理损伤中具有重要的作用。因此，本文就中性粒细胞在结核病中作用的研究进展做一综述。

1 中性粒细胞在结核病的早期免疫

1.1 中性粒细胞在结核病的趋化与募集

病原体侵入机体后，中性粒细胞被白细胞介素-8 （interleukin-8，IL-8/CXCL8）等趋化因子激活，其G蛋白耦联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）构象发生改变，从而使中性粒细胞在流动条件下牢固黏附于内皮细胞，然后顺着补体 5a（complement component 5a，C5a）等趋化因子的浓度梯度在血管内皮上迁移，最后通过周细胞间隙进入受感染区域[3]。有一项研究表明，新型C型凝集素受体CLEC9A在与结核分枝杆菌结合后介导激活脾脏酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径，选择性上调 CXCL8，进而促进中性粒细胞的募集[4]。但是，在较早的一项小鼠实验表明，内皮细胞大量表达的胞外-5’-核苷酸酶（CD73）在缺氧情况下会刺激内皮细胞形成内皮屏障，降低结核分枝杆菌感染后中性粒细胞的大量募集[5]。而另一项斑马鱼的实验研究也表明，在分枝杆菌感染后，机体的miR-206会明显上调，通过抑制Cxcl12/Cxcr4信号轴，进而减少中性粒细胞向感染区域的募集[6]。可见，结核分枝杆菌对中性粒细胞的募集及趋化作用是双向的，而且是多途径并且受体内理化因素的影响，这突出了中性粒细胞对分枝杆菌免疫反应的复杂性。

1.2 中性粒细胞在结核病的吞噬作用

中性粒细胞在到达感染部位后，表达出Fc受体、C型凝集素受体、模式识别受体、补体受体等受体[7]，还会对结核分枝杆菌表面的海藻糖二霉菌酸酯（trehalose-6，6-dimycolate，TDM）及硫脂（sulpholipids，SL）选择性识别[8]，继而启动吞噬作用：由伪足沿着与细菌结合的部位从四周伸展包抄，最后收口直至脱离质膜形成吞噬体。Wilson等[9]发现，C型凝集素受体中CLECSF8影响结核分枝杆菌与中性粒细胞结合，其缺乏会明显减少结核分枝杆菌与中性粒细胞的结合，降低中性粒细胞的吞噬作用。中性粒细胞表面存在的许多模式识别受体，尽管在过去的研究中被认为在控制体内结核分枝杆菌感染方面是冗余的[10]，但是CLECSF8的研究让人们意识到其在中性粒细胞吞噬中的重要作用。另一方面，分枝杆菌膜糖脂在与人中性粒细胞质膜脂筏中的乳糖神经酰胺 （lactosylceramide）结合后降低了诱导部分激酶的集合能力，阻碍了吞噬溶酶体的形成[11]，从而使结核分枝杆菌在宿主细胞内存活和复制。结核分枝杆菌上的膜糖脂对乳糖神经酰胺的作用或许能成为抗结核治疗的新靶点。

1.3 中性粒细胞的呼吸爆发、中性粒细胞胞外杀菌网络（neutrophil extracellular traps，NETs）在结核病中的作用

在中性粒细胞吞噬病原体后形成吞噬溶酶体，激发细胞的呼吸爆发形成活性氧（reactive oxygen species，ROS）。吞噬溶酶体上的NADPH氧化酶会通过将电子转移到分子氧上生成超氧阴离子，然后通过超氧化物歧化酶及髓过氧化物酶转化为过氧化氢、次氯酸和其他反应性中间体，从而消除病原体[12]。然而在一项小鼠的实验中发现，结核分枝杆菌的分泌蛋白PPE2与NADPH氧化酶的胞质亚基p67相互作用，并阻止p67phox和p47phox定位到膜上，破坏了NADPH氧化酶复合物的组装，导致NADPH 氧化酶活性降低，抑制活性氧的产生，从而有利于结核分枝杆菌在巨噬细胞中的存活[13]。更早的研究也发现，结核分枝杆菌会分泌出超氧化歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）、整合膜蛋白（integral membrance protein）和巯基氧化还原酶（thiol-oxidoreductase）等形成膜相关氧化还原酶复合物 （membrane-associated oxidoreductase complex，MRC），通过氧自由基解毒和硫醇稳态之间的协调来克服恶劣的氧化环境。结核分枝杆菌自身分泌等多种蛋白使其有效躲避活性氧作用，降低中性粒细胞的杀菌作用[14]。因此，如何抑制相关蛋白的分泌，增加活性氧作用或许能成为另一个治疗途径。

中性粒细胞除了通过活性氧及脱颗粒作用破坏病原体外，还释放一种称为NETs的结构，可以捕获和杀死微生物。NETs是中性粒细胞的一种独特的免疫应答方式，其主要是由DNA组成骨架，多种蛋白包裹于内，通过其特殊的三维结构捕获病原体，并通过抗菌蛋白对病原体进行杀灭[15]。Ⅰ型干扰素是由先天性免疫细胞介导转录的抗病毒转录因子，但在活动性肺结核中，Ⅰ型干扰素的转录会增多，进而促进中性粒细胞形成NETs，NETs会引起免疫性损伤并最终破坏组织，反而推动了病情的进展[16]。另一面NETs因与游离的分枝杆菌有相似内径而能容纳分枝杆菌[17]，从而保护细菌免受机体环境的压力，反而促进了其传播。研究发现，NETs结构对多数病原体如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌都表现出明显的杀菌作用[18]，然而其对结核分枝杆菌的杀菌作用却有所减弱，不但保护了细菌的生存，同时也促进了细菌对组织的损伤，因此抑制该结构的产生或许能有效减缓病情的发展。

1.4 中性粒细胞在结核病中的自噬与凋亡作用

自噬是一种确保细胞在压力条件下生存的机制，是将受损的细胞器等物质通过溶酶体形成自噬体，进行降解再利用的过程，其也参与机体生长发育、免疫、肿瘤等病理生理过程。在过去，我们已经知道中性粒细胞可以通过自噬杀灭炭疽芽孢杆菌[19]，而在最近的研究中显示，在感染结核分枝杆菌后，结核分枝杆菌抗原会刺激中性粒细胞表达共刺激因子信号淋巴细胞激活分子家族成员1（SLAMF1），其会激活及诱导自噬体的形成，增强中性粒细胞的自噬作用。但同时该组研究人员也发现，与健康人群相比，结核病患者中性粒细胞的自噬水平显著降低。SLAMF1 水平较低，考虑与某些人类病理过程中共刺激分子的失衡有关[20]，仍需进一步研究其中的矛盾机制。另一方面，杜金艳等[21]发现，感染结核分枝杆菌后，患者外周血中控制中性粒细胞自噬的相关基因Beclin 1的表达明显下降，中性粒细胞中自噬标志性蛋白LC3降低。表明在结核分枝杆菌感染后，中性粒细胞自噬功能会受到限制。

凋亡对于炎症消退至关重要，中性粒细胞形成ROS、脱颗粒等过程后的产物会对机体自身造成损害，需要及时发生凋亡而易于被巨噬细 胞吞噬，并从系统中分解，这一过程的延迟及失效可导致组织损伤及病理改变。在早期的实验中证实，凋亡的中性粒细胞通过激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase-1）和白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）调节结核分枝杆菌感染的巨噬细胞的细胞因子释放，增强了控制毒性结核分枝杆菌细胞内生长的能力[22]。但是，另一方面结核分枝杆菌利用毒力因子来限制体内中性粒细胞的凋亡，并增加中性粒细胞的坏死[23]。这一过程减弱了上述控制细菌胞内生长的能力，反而增加了中性粒细胞坏死的数量，坏死的中性粒细胞会削弱机体对结核分枝杆菌的控制，降低保护性细胞因子反应[24]。

2 中性粒细胞在结核肉芽肿中的作用

与大部分细菌感染不同，人类机体的防御机制难以完全清除结核分枝杆菌，当活动性结核病被控制后，结核分枝杆菌会进入休眠状态[25]，体内形成肉芽肿，它是由上皮样细胞聚集形成的保护结构以隔离结核分枝杆菌，避免其造成进一步损害，但同时其也成为扩大传播的一种机制[26]。中性粒细胞是肉芽肿内的主要炎症细胞之一[27]。Gideon等[28]在结核分枝杆菌感染猕猴实验中发现，中性粒细胞表达肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）和白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）等多种细胞因子，与外周血相比，肺肉芽肿内的中性粒细胞具有更高程度的多功能性，参与了肉芽肿的细胞因子环境，可能是结核肉芽肿中重要的免疫调节细胞。Scott等[29]发现，中性粒细胞胞质大量存在的钙结合蛋白S100A8/A9在结核慢性肉芽肿中间接或直接地介导中性粒细胞的积聚，此外，在募集至肺部后，结核分枝杆菌感染诱导的 S100A8 / A9 蛋白可能会调节中性粒细胞的吞噬受体表达，从而使中性粒细胞的结核分枝杆菌感染增加，促进了疾病的进展。在过去，肉芽肿的组织坏死曾被认为是疾病转归的标志，近期的斑马鱼实验证明，中性粒细胞随时间在肉芽肿内的募集，并发现与肉芽肿坏死成反比，一定程度的肉芽肿坏死可能是控制分枝杆菌感染的有效过程，是平衡感染与免疫的结果[30]。

3 总结

综上所述，在结核感染过程中，中性粒细胞如同一柄双刃剑，一方面通过加强早期募集、吞噬，增强功能性等正面抵抗着结核分枝杆菌的入侵，另一方面，NETs结构会被结核分枝杆菌用于逃避免疫，增强机体的炎性反应，而晚期的中性粒细胞聚集则会加强肺部病理损伤。此外，中性粒细胞在结核感染过程中表现出异质性，如出现更多的低密度中性粒细胞（low density neutrophils，LDNs）[31]，在肉芽肿内的中性粒细胞表现出更高程度的多功能性。其中的部分机制尚未完全清楚。结核感染过程中，中性粒细胞与其他免疫细胞间的相互影响与调节，及与结核分枝杆菌的相互作用仍有待进一步研究阐明，这将有助于更好地理解其在结核病中的作用。