内翻畸形膝关节骨关节炎患者关节液对软骨细胞的影响

王屹侃 李钟陈 金建强

膝关节骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种常见的慢性退行性疾病，以疼痛、关节活动功能障碍为主要特征［1-2］。KOA发生后，软骨磨损，关节间隙变窄，可出现畸形，其中内翻畸形是膝关节常见的畸形表现［3］。内、外侧间室关节软骨处于相同内环境，在炎性关节液中长期暴露，但由于内翻畸形，应力集中于内侧间室。因此，临床上常见内侧间室关节软骨严重退变，而外侧间室软骨仍然良好［4］。目前国内外关于间室软骨退变分子生物学水平初步评价的报道尚少。因此，本研究初步探讨内翻畸形有、无外侧间室关节软骨病变的KOA患者关节液对软骨细胞增殖、凋亡及自噬的影响，以期为临床预防和干预KOA提供指导依据。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 12只普通级新西兰大白兔，4周龄，体质量为0.42~0.45 kg，购于浙江中医药大学实验动物研究中心，饲养于中心屏障系统内，动物许可证号：［SYXK（浙）2013-0184］。本研究所涉及的动物操作获得浙江中医药大学动物中心伦理委员会的批准（伦理编号：ZSLL-2019-124）。

1.2 仪器及试剂 白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）ELISA试剂盒购于酶免公司；GAPDH抗体（批号：60004-1-1g）购于华安生物；甲苯胺蓝试剂盒（批号：G3668）购于索莱宝；细胞增殖核抗原（PCNA）、Bcl-2、Bax、LC3B、P62、Beclin-1、BMP2、mTOR抗体购于Abcam公司；PI3K、AKT（批号：AF6242、AF6261）购于Affinity公司。AE2000倒置显微镜（Motic）， C6流式细胞仪（BD）。

1.3 软骨细胞的分离与培养 无菌切取新西兰大白兔关节软骨，解剖刀剪成碎块（1 mm×1 mm×1 mm），经透明质酸酶、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原依次消化，加入含10% FBS的DMEM：F12（1∶1）培养液制成单细胞悬液，传代培养，以甲苯胺蓝染色进行软骨细胞鉴定。

1.4 膝关节关节液标本的收集与分组 按照中华医学会骨科学分会制定的《骨关节炎诊治指南（2018年版）》［5］，选取本院2019年5月至8月经影像学确诊为内翻畸形伴有外侧间室关节软骨病变的KOA患者7例及内翻畸形无外侧间室关节软骨病变的KOA患者10例。常规消毒，铺单，沿髌骨下缘入路行膝关节穿刺，抽取5 mL关节液原液。关节液置于EP管，以3,000 r/min的速度在4 ℃下离心30 min，取上清液，经0.45 μm和0.22 μm微孔滤过膜过滤，置于4℃冰箱保存备用。内翻畸形伴有外侧间室关节软骨病变的KOA关节液设为观察组，内翻畸形无外侧间室关节软骨病变的KOA关节液设为对照组。

1.5 关节液炎症因子生化分析 参照相关试剂盒说明，采用ELISA法检测观察组及对照组关节液中IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP-13的含量水平。

1.6 CCK-8法检测软骨细胞生长情况 取P1代软骨细胞，接种于96孔板，3×103/孔，分3组各设6个复孔平行对照，培养12 h，弃去培养基。使用10%内翻畸形伴有外侧间室关节软骨病变的KOA关节液+10%FBS的DMEM：F12（1∶1）培养液设为实验组，使用10%内翻畸形无外侧间室关节软骨病变的KOA关节液+10% FBS的DMEM：F12（1∶1）培养液设为阴性对照组，2 d/次进行换液；使用只含10% FBS的DMEM：F12（1∶1）培养液设为空白组。各组分别于0、1、2、3 d避光条件下加入CCK-8试剂，3 h后，采用酶标仪在450 nm波长下检测吸光度（OD）值，用以分析细胞增殖能力。

1.7 流式细胞术检测软骨细胞凋亡 于6孔板接种对数生长期软骨细胞，细胞贴壁后，使用培养液，按上述分组，处理24 h后，胰酶消化，离心弃上清液，预冷PBS洗涤，调整细胞浓度至1×106个/mL，5 μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15 min，上机前5 min，加入5 μL PI染色。采用流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率，实验重复3次。

1.8 免疫荧光法检测软骨细胞LC3B及P62蛋白表达 选取第3代软骨细胞爬片，细胞贴壁后按上述分组处理后，加预冷4% PFA固定，PBS漂洗；加0.5%Triton X-100通透细胞膜，加3% BSA封闭液封闭，加一抗（LC3B，P62），孵育，PBS漂洗，加二抗，室温下避光孵育0.5 h，PBS漂洗，加DAPI对细胞核进行染色，抗荧光淬灭剂封片，倒置荧光显微镜下观察拍照。

1.9 Western blot法检测软骨细胞自噬及凋亡相关蛋白的表达 软骨细胞以RIPA裂解液冰上裂解30 min后，BCA法测定蛋白浓度，5% SDS-PAGE浓缩胶电泳分离蛋白，转PVDF膜。封闭液封闭，TBST洗膜3次，加入含一抗，4 ℃振荡过夜孵育，加入相应二抗，室温孵育1~2 h，TBST洗膜3次。以GAPDH为内参，ECL化学发光试剂盒处理，Chemi capture软件拍摄处理图像。

1.10 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件。计量资料多组间用One-way-ANOAY单因素方差分析，组间比较采用SNK分析。方差不齐者采用Kruskal-Wallis H检验。所有数据以均值（）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组关节液IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP-13含量水平比较 采用ELISA法测定两组关节液中IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP-13的含量水平，观察组关节液IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-13水平显著高于对照组（P＜0.01）。见表 1。

表1 两组关节液IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP-13含量水平比较［pg/mL，（）］

表1 两组关节液IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP-13含量水平比较［pg/mL，（）］

注：与观察组相比，*P＜0.05

组别 n IL-1β TNF-α IL-6 MMP-13观察组 7 64.65±10.32 106.48±8.15 76.54±14.6 230.57±61.14对照组 10 41.05±5.64* 65.36±7.65* 51.26±4.68* 176.72±53.16*

2.2 软骨细胞形态观察 软骨细胞分离培养第5天时正常贴壁生长，光镜下观察可知细胞呈多边形，经甲苯胺蓝染色鉴定细胞为软骨细胞来源。见图1。

图1 软骨细胞形态观察（×400）

2.3 CCK-8法检测软骨细胞增殖 与空白组相比，第1天细胞活力无显著差异（P＞0.05），第2、3天实验组OD值显著降低（P＜0.01），生长减缓，而阴性对照组较空白组无显著差异（P＞0.05）。见图2。

图2 CCK-8法检测共培养软骨细胞增殖

2.4 流式细胞术检测软骨细胞凋亡与空白组相比，实验组软骨细胞的凋亡率显著升高（P＜0.01），而阴性对照组软骨细胞凋亡率无显著变化（P＞0.05）。与阴性对照组相比，实验组软骨细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）。见图3。

图3 共培养软骨细胞凋亡率比较

2.5 免疫荧光法检测软骨细胞LC3B、P62蛋白表达 与空白组比较，实验组软骨细胞LC3B荧光强度显著加强（P＜0.01），P62 荧光强度显著减弱（P＜0.01），阴性对照组LC3B和P62荧光强度差异不显著（P＞0.05）；且实验组与阴性对照组间LC3B、P62荧光强度有显著差异（P＜0.01）。见图 4。

图4 共培养软骨细胞LC3B和P62蛋白表达水平比较

2.6 Western blot法检测软骨细胞自噬相关蛋白的表达 与空白组相比，实验组与阴性对照组软骨细胞中PCNA、Bcl-2、P62与BMP-2的蛋白表达水平均显著降 低（P＜0.05）；Bax、LC3、Beclin-1、PI3K、AKT 与mTOR的蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。与阴性对照组相比，实验组软骨细胞中PCNA、Bcl-2、P62、BMP-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；Bax、LC3蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。见图5。

图5 共培养软骨细胞PCNA、Bcl-2、Bax、LC3Ⅱ、P62、Beclin-1、BMP-2、PI3K、AKT与mTOR蛋白表达水平

3 讨论

KOA是一种以关节软骨细胞受到损伤，胶原降解丢失，形成骨赘等为主要病理特征的慢性退行性疾病［6］。临床上，内翻畸形内、外侧间室关节软骨退变程度差异显著，但相关分子生物学研究报道较少。研究表明，IL-1β、TNF-α、IL-6等炎性介质在OA进展中具有重要作用［7］。TNF-α及IL-1β可干扰软骨细胞正常代谢，参与软骨吸收，进而破坏软骨关节［8］。本研究通过分别收集内翻畸形有、无外侧间室关节软骨病变KOA患者的关节液，发现观察组的IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP-13水平较阴性对照组显著升高，推测炎性因子水平升高可能促进KOA病变。研究表明，软骨细胞数量的减少与KOA的进展密切相关［9］。本研究中，内翻畸形伴有外侧间室关节软骨病变的KOA患者关节液抑制新西兰兔软骨细胞生长活力，具有抑制软骨细胞增殖的作用。此外，伴有外侧间室关节软骨病变的KOA患者关节液较无外侧间室关节软骨病变的患者关节液更易诱导软骨细胞凋亡。

PCNA可反映细胞增殖活动，Bax传递凋亡信号，为促凋亡蛋白，Bcl-2可与Bax形成异二聚体，阻断凋亡信号，为抗凋亡蛋白［10］。本研究中，两组KOA关节液均可显著下调PCNA、Bcl-2、BMP-2蛋白表达水平，上调Bax蛋白表达，且实验组作用更显著，提示内翻畸形KOA关节液具有抑制软骨细胞增殖的作用。

自噬是一种分解代谢过程，可通过吞噬和降解受损的细胞器和蛋白质来维持能量水平和更新细胞器，维持细胞内环境稳定。研究发现，其参与的关节软骨退化过程及软骨细胞自噬缺陷与KOA的发生密切相关［11］。KOA病变初期，自噬相关蛋白LC3与自噬调节物Beclin-1在软骨细胞中表达增加，自噬增强，可保护软骨细胞；而KOA中后期，代偿能力不足，自噬则被抑制，致细胞损伤［12］。此外，PI3K/AKT信号传导，可调控mTOR参与自噬［13］。本研究中，KOA关节液可下调软骨细胞中P62蛋白表达水平，上调LC3 、Beclin-1、PI3K、AKT与mTOR蛋白表达，提示内翻畸形KOA关节液可激活软骨细胞自噬机制，且伴有外侧间室关节软骨病变的KOA关节液增强细胞自噬的作用尤为显著。

综上所述，内翻畸形的KOA关节液具有抑制体外软骨细胞增殖，诱导细胞凋亡，激活软骨细胞自噬的作用，这可能是促进KOA进程的作用机制之一。然而，软骨细胞深层的潜在作用机制仍有待进一步研究。