贵州产油麻血藤总黄酮提取工艺研究

杨从武，罗九凤

(1黔东南苗族侗族自治州食品药品检验检测中心，贵州 凯里 556000；2贵州医科大学第二附属医院(原418医院)，贵州 凯里 556000)

油麻血藤药材为我省少数民族习用药材，是豆科植物常春油麻藤MucunasempervirensHemsl.的干燥藤茎，全年均可采收，除去枝叶切段或片，晒干，具有活血补血、疏通经络、治疗风湿疼痛、四肢麻木、血虚、月经不调、闭经等功效[1]。油麻血藤对土壤要求不严，喜肥沃，生长于亚热带森林灌木、溪谷等地，耐阴、耐旱、耐贫薄的特点[2]。主要分布于亚热带、温带地区，产中国贵州、云南、陕西等[3]。我省主产凯里炉山镇、兴义万峰林、荔波佳荣镇等地。据文献报道，主要含多种脂肪酸，占1%～10%[4]，总黄酮类占12.43%[5](主要有刺芒柄花素、大豆黄素、3，7-二羟基-6-甲氧基二氢黄酮)。同时含有酚类、鞣质、挥发油等成分。

1 仪器与材料

1.1 药材

油麻血藤于2017年4月采自贵州荔波。经贵州中医药大学孙庆文教授准确鉴定为豆科植物常春油麻藤MucunasempervirensHemsl.的干燥藤茎。凭证标本存放于贵州中医药大学生药实验室。取干燥药材打粉过四号筛，密封存储于广口瓶中，备用。

1.2 仪器

紫外分光光度计(UV-2600)；超声波清洗器(SK8200HP)；电热恒温水浴锅(单列六 5L-DK-98-ⅡA)；500克摇摆式高速中药粉粹机(DFY-500)；电子天平(XPE205)。

1.3 试剂

芦丁(中国食品药品检定研究院，含量：92.4%(UV)，批号：10080-201811)，甲醇，95%乙醇，乙酸乙酯、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝均购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液及标准曲线制备

精密称取标准物质0.01175 g(芦丁92.4%(UV)，批号：10080-201811)，置50 mL量瓶中，加85%甲醇适量，超声溶解，放冷，加85%甲醇至刻度，摇匀，即得(每1 mL含芦丁0.21714 mg)。量取上述溶液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL，分别置25 mL量瓶中，各加水至6 mL[6]，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min[6]，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min[6]，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min[6]，即得。立即在510 nm处测定各个溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线[7]。其回归方程为Y=0.01379X-0.01920，r=0.99966，在测定浓度为8.686～52.114 μg/mL范围内线性关系良好，可以进行定量分析。

2.2 供试品溶液的制备

精密取油麻血藤约0.25 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入85%甲醇100 mL，密塞，称重，超声30 min，放冷，再次称重，用85%甲醇补足减失补重，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL置25 mL量瓶中，照2.1项下方法，自“加水至6 mL”起依法操作，并测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量[6]。

2.3 单一因素试验考察

2.3.1 不同提取溶剂对油麻血藤总黄酮含量的影响

精密称取油麻血藤3份，各约0.25 g，置具塞锥形瓶中，各精密加甲醇、乙醇、乙酸乙酯100 mL，超声提取30 min照2.2项下依法操作，并计算其总黄酮含量。

2.3.2 不同溶剂比例对油麻血藤总黄酮含量的影响

精密称取油麻血藤4份，各约0.25 g，置于具塞锥形瓶中，各精密加入100%、85%、60%、20%的甲醇溶液各100 mL，超声30 min，照2.2项下依法操作，并计算其总黄酮含量。

2.3.3 不同提取方式对油麻血藤总黄酮含量的影响

精密称取油麻血藤3份，各约0.25 g，置具塞锥形瓶中，各精密加入85%的甲醇100 mL，分别超声30 min，水浴回流1 h，冷浸过夜，照2.2项下依法操作，并计算其总黄酮含量。

2.3.4 不同超声时间对油麻血藤总黄酮含量的影响

基于“2.3.3”项下85%甲醇超声提取30 min，精密称取油麻血藤2份，各约0.25 g，置于具塞锥形瓶中，各精密加入85%的甲醇100 mL，分别超声15 min、60 min，取出，放冷，照2.2项下依法操作，并计算其总黄酮含量。

2.3.5 不同料液比对油麻血藤总黄酮含量的影响

基于“2.3.3”项下85%甲醇超声提取30 min，精密称取油麻血藤约0.5 g和约0.125 g，置于具塞锥形瓶中，分别加入85%的甲醇100 mL，超声30 min，照2.2项下依法操作，并计算其总黄酮含量。

2.4 正交试验

通过对不同提取溶剂、不同溶剂比例、不同提取方式、不同超声时间、不同料液比进行考察，选择对贵州产油麻血藤总黄酮提取影响较大的因素进行正交试验，筛选最优试验方案进行验证[7]。

2.5 单一因素试验结果

经考察不同提取溶剂对总黄酮含量的影响为：甲醇>乙醇>乙酸乙酯。不同提取溶剂比例对总黄酮含量的影响为：85%>60%>100%>20%。不同提取方式对总黄酮含量的影响为：超声>回流>冷浸。不同超声时间对总黄酮含量的影响为：30 min>60 min>15 min。不同料液比对总黄酮的含量的影响为：1∶400>1∶800>1∶200。

2.6 正交试验结果

单一因素试验考察发现，料液比(A)、超声时间(B)、甲醇浓度(C)对提取量影响较大，因此选择提取时间、料液比、甲醇体积分数3个因素进行正交试验设计，每个因素均设置4个水平[7-8](表1)。

表1 L16(43)因素水平

3 数据分析

3.1 因素水平直观分析

由表2中RA=0.45，RB=0.07，RC=0.73，得出油麻血藤总黄酮的提取影响因素为C(甲醇浓度)>A(料液比)>B(超声时间)。

表2 正交试验结果

3.2 方差分析

由表3中离差平方和项可看出，试验误差对本次正交试验提取总黄酮含量的影响甚微，主要影响因素还是各提取条件。同时查“十三五”规划教材《医药数理统计》第5版附表8[7]得F0.05(3，9)=3.86，F0.01(3，9)=6.99，再结合表中F值项下FA、FB、FC值表明：因素A(料液比)对油麻血藤总黄酮的提取有显著影响；因素B(超声提取时间)对油麻血藤总黄酮的提取影响很小；因素C(甲醇浓度)对油麻血藤总黄酮提取影响非常明显。由表2和表3综合分析得出，A4B2C2最佳，即料液比1∶400(g∶mL)；超声30 min；85%甲醇100 mL。

表3 方差分析

3.3 验证试验

根据正交试验得到A4B2C2方案，照2.2项下方法，重复测定6份贵州荔波县产油麻血藤，其总黄酮的平均含量是7.06%，RSD=0.96%。

4 结果

通过单一因素试验考察及正交试验结果可知，影响总黄酮含量的因素为：因素A(料液比)对总黄酮的提取有显著影响；因素B(超声提取时间)对总黄酮的提取影响不显著；因素C(甲醇浓度)对荔波常春油麻藤总黄酮的提取影响非常显著。另外，料液比为1∶400，对药材中总黄酮的提取虽然提取率高，但应用于实践存在一定困难，在下一步研究中我们会改进。综上所述，该提取方法较为简便、易于重现，可作为贵州产油麻血藤药材质量评价的依据。