秸秆覆盖配施氮肥根际土真菌群落及其与小麦产量的关系

陈松鹤,向晓玲,雷 芳,邹乔生,艾代龙,郑 亭,黄秀兰,樊高琼

四川农业大学农学院农业部西南作物生理生态与耕作重点实验室, 成都 611130

土壤微生物是影响肥力与质量状况的关键因素[1],对土壤肥力形成与发展、植物发育生长与保持生态稳定等多个领域有关键的影响[2—3]。在四川丘陵旱地雨养农业区土壤有机质缺乏,秸秆覆盖还田由土壤微生物驱动分解释放养分,提高土壤有机质含量[4]。相较于细菌,真菌有更强的吸收氮素和磷素及分解土壤中植物残体和复杂化合物的能力[3,5]。因此,研究秸秆覆盖与氮肥定位施用土壤真菌群落变化及其驱动因素对提升石灰性紫色土肥力和促进小麦生产具有重要意义。

秸秆作为一种有机肥源富含有机质及各营养元素,农业生产中应用较为广泛[6]。秸秆还田不仅提高土壤速效养分的含量[4,7],而且为土壤微生物的生长和繁殖提供适宜的碳源和氮源[8—9],从而提高了微生物多样性[8]和改变其群落结构[10]。真菌作为土壤中常见的微生物具有很强的降解复杂化合物能力[11],在秸秆降解的过程中,真菌的分解作用占据优势[12]。前人研究表明[13—15],秸秆还田有助于提高真菌群落的丰富度,改变真菌群落结构,但也有研究认为秸秆还田会降低真菌Alpha多样性[16]。化学氮肥是提高作物产量常用肥料,但长期施用氮肥会降低真菌群落多样性和改变其群落结构[17—18]。此外,目前有关土壤真菌的研究主要集中在驱动真菌群落结构变化的土壤环境因素、土壤类型、施肥方式和栽培措施等方面[2,16,19—21]。秸秆覆盖和施氮对土壤真菌群落的影响虽有研究[22],但针对秸秆覆盖配施氮肥如何影响根际真菌群落结构及促进作物生产力研究较少。

本研究基于石灰性紫色土连续4年秸秆覆盖与施氮定位试验,采用Illumina Miseq测序技术,研究真菌群落结构与多样性对秸秆覆盖与施氮的响应,并结合土壤养分揭示其驱动因素及与小麦产量的关系,为石灰性紫色土培肥地力和提高小麦生产力提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

该定位试验于2015年在四川省眉山市仁寿县珠嘉镇踏水村(30°04′ N,104°13′ E)进行试验地属亚热带季风湿润气候,丘陵地貌,海拔482 m,年均降雨量1009.4 mm,年均气温17.4 °C。土壤类型为石灰性紫色土。前茬作物为夏玉米,研究对象冬小麦为后茬作物。2015年试验开始时土壤(0—20 cm)基础肥力：pH 7.82 (土∶水= 1∶2.5),有机质16.9 g/kg,全氮0.83 g/kg,全磷0.86 g/kg,全钾14.0 g/kg,碱解氮68.2 mg/kg,速效磷9.3 mg/kg,速效钾158.2 mg/kg。

1.2 试验设计与方法

试验采用二因素裂区设计,主区为玉米秸秆粉碎覆盖(SM)与不覆盖(NSM)；裂区为两种氮水平为：0(N0)和180(N1)kg/hm2,共计4个处理,每个处理均设4次重复,小区面积为30 m2(6 m×5 m)。所有试验小区氮肥为尿素(N 46.2%),磷肥和钾肥分别为过磷酸钙(P2O512%)和氯化钾(K2O 60%),磷钾肥用量均为75 kg/hm2。60%的氮与所有磷、钾肥作为基肥撒施,剩余氮肥于小麦拔节期作为追肥。于每年8月下旬实施玉米机械粉碎均匀撒于试验小区表面,秸秆粉碎长度约5 cm,覆盖量为8 000 kg/hm2。并于2018年10月底免耕开沟播种小麦(川麦104),基本苗为2.25×106株/hm2。于2019年5月上旬收获。其他栽培管理措施同当地大田生产。

1.3 样品采集

于2019年小麦开花期采集土壤样品,此时期根际效应最为强烈[23]。每个处理采集15株小麦植株,将整株小麦挖出,采用抖根法将附着在根系上的土壤作为根际土,使用冷藏箱将样品运输至实验室,并在-80℃下储存,直至DNA提取。同时采用“S”形5点采样法采集0—20 cm非根际土混为1个土样,在室内通风处自然风干,用于土壤养分测定。于小麦成熟期选定4 m2进行小麦产量测定。

1.4 项目测定与方法

1.4.1 土壤理化性状测定

1.4.2 土壤DNA的提取和内源转录间隔区(ITS)基因的高通量测序

准确称取0.5g新鲜土壤使用美国MOBIO公司生产的Fast DNA Spin Kit for Soil 试剂盒参照说明书提取土壤总DNA。采用2%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的纯度以及浓度。实验使用真菌18S引物为ITS5F:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′, ITS2R:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。扩增体系为25 μL,主要构成为4 μL 5× FastPfu Buffer,2 μL dNTPs(2.5 mmol/L),正反引物各0.8 μL(5 μmol/L),0.4 μL FastPfu Polymerase和10 ng模板DNA,ddH2O进行补充至体积。扩增条件所设定的具体参数是98℃ 预变性2 min,设定为98℃持续变性处理10 s,设定为55℃进行退火处理并持续30 s,设定为72℃进行延伸处理持续30 s,持续30个循环。各样本均进行3次重复的操作,对同样本聚合酶链式反应(PCR)产物进行有效混合之后,运用2%琼脂糖凝胶进行电泳测定工作,完成前述操作后进行回收扩增子的处理。PCR扩增物用AgencourtAMPure珠纯化(Beckman Coulter,使用PicoGreen dsDNA试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA))开展定量分析,以同样浓度进行混合处理。采用Illumina 公司 MiSeq 测序仪完成序列分析(由上海派森诺生物科技股份有限公司测定)。获得原始序列后进行质量控制,在97%序列相似性水平上聚类成可操作的分类单元(OTUs),对照RDP和UNITE数据库进行分类注释,获取对应的真菌分类学信息。测序获得的具体数据已传递到NCBI SRA数据库,具体编号参数是：SRP346982。

1.5 数据统计

使用QIIME2 2019.4 (https://docs.qiime2.org/2019.4/tutorials/)按照官方教程中的描述处理序列。使用Microsoft Excel 2019整理数据,IBM SPSS Statistics 26进行相应的双因素方差分析和相关分析,采用Fisher氏最小显著差检验法(LSD)进行平均值显著性多重比较(P<0.05)。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)和冗余分析(RDA)使用R v4.1.0软件的vegan包进行；利用主成分分析(PCA)分析真菌群落与小麦产量的关系；线性判别分析效应量(LEfSe)分析不同条件下微生物群落的特征,以线性判别分析(LDA)值≥ 4.5被认为是每个处理的显著差异物种。采用Origin 2021绘图。

2 结果与分析

2.1 秸秆覆盖与施氮对小麦产量及土壤养分的影响

秸秆覆盖和施氮提高了小麦产量(图1),差异显著。秸秆覆盖处理较不覆盖处理小麦产量增加40.3%。不覆盖施氮处理(NSMN1)比无覆盖不施氮处理(NSMN0)小麦产量显著提高75%；覆盖施氮处理(SMN1)较覆盖不施氮处理(SMN0)小麦产量显著提高92%。

图1 秸秆覆盖与施氮处理下冬小麦产量

表1 秸秆覆盖与施氮对土壤养分的影响

2.2 秸秆覆盖与施氮对根际真菌多样性和群落结构的影响

由图2可知,秸秆覆盖和施氮对小麦根际真菌群落丰富度(Chao1指数)和多样性(Shannon指数)均有显著或极显著的影响。秸秆覆盖(SM)相对无覆盖(NSM)处理有利于提高小麦根际真菌群落丰富度与多样性。无论秸秆覆盖与否,施氮处理(N1)与不施氮(N0)处理相比显著降低了真菌群落丰富度和多样性；真菌群落丰富度与多样性以SMN0处理最高。真菌群落以子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)与被孢霉门(Mortierellomycota)为所有处理的优势门(图3),其相对丰度分别为26%—49%、4.61%—26.9%和2.71%—14.5%。SM处理相较NSM处理显著增加担子菌门和降低被孢霉门相对丰度,子囊菌门的相对丰度无显著差异(表2)。在NSM条件下,施氮显著增加子囊菌门的相对丰度,担子菌门与被孢霉门相对丰度显著降低,在SM处理中,施氮处理显著降低子囊菌门的相对丰度,担子菌门的相对丰度显著增加,被孢霉门的相对丰度降低,但无显著差异。在属水平上(图3；表2),SM处理较NSM处理显著增加了光盖伞属(Psilocybe)、弯孢菌属(Curvularia)和黑孢霉属(Nigrospora)的相对丰度,被孢霉属(Mortierella)、球腔菌属(Mycosphaerella)、帚枝霉属(Sarocladium)、镰刀菌属(Fusarium)和柱霉属(Scytalidium)的相对丰度显著降低,蛋白单胞属(Pyrenochaetopsis)的相对丰度无显著差异。在NSM处理中,施氮处理较不施氮处理显著增加了球腔菌属、弯孢菌属和帚枝霉属的相对丰度,显著降低被孢霉属和柱霉属的相对丰度；在SM处理中施氮则显著增加光盖伞属、弯孢菌属、帚枝霉属和柱霉属的相对丰度,显著降低被孢霉属的相对丰度。

图2 秸秆覆盖与施氮处理下冬小麦根际真菌群落多样性

图3 秸秆覆盖和施氮处理下小麦根际土壤细菌群落组成

表2 秸秆覆盖与施氮处理对真菌群落结构的方差分析

2.3 秸秆覆盖与施氮对小麦根际土壤真菌群落结构间差异的影响

采用主坐标分析(PCoA),第一、二主坐标轴对相应结构变异产生的解释量为37.8%和22.8%(图4)。相同处理的4个重复之间,得出的实际距离参数接近,结构相似度较高。SM处理与NSM处理明显区分开,NSMN0和NSMN1处理在PC1轴上的投影较为接近,SMN1和SMN0处理在PC1轴上的投影与不覆盖处理两种施氮水平明显区分开,说明秸秆覆盖还田改变了土壤真菌群落结构。通过组间群落差异分析(图5),SM处理和NSM处理分别有15个和14个类群有显著差异。对NSM处理起重要作用的是被孢霉属和根霉属,SM处理主要是柱霉属、光盖伞属和弯孢菌属。说明秸秆覆盖和施氮改变了土壤中真菌特征类群。

图4 秸秆覆盖与施氮处理下主坐标分析

图5 秸秆覆盖和施氮肥处理下小麦根际土壤真菌的组间群落差异(LEfSe)分析

2.4 真菌群落与土壤环境因子及其与产量的关系

图6 秸秆覆盖和施氮肥处理下小麦根际土壤真菌群落和环境因子的冗余分析(RDA)

图7 秸秆覆盖和施氮处理下小麦根际土壤真菌群落与小麦产量的主成分分析

3 讨论

3.1 秸秆覆盖与施氮提高了土壤养分和冬小麦产量

3.2 秸秆覆盖与施氮优化了根际真菌群落结构,提高冬小麦生产力

真菌是土壤中重要的分解者,对土壤中植物残体和纤维素、半纤维素、木质素等难降解有机物具有较强的分解能力[3]和吸收转化氮素的能力[37]。覆盖处理提高真菌群落多样性,施氮则降低真菌群落多样性,这与秸秆覆盖后的有机质增加、土壤温度及湿度等存在非常密切的联系[38—39]。本研究中,秸秆覆盖相比单施氮肥增加了真菌群落的多样性,从而提高了土壤真菌群落结构的稳定性。有研究表明[40—41],长期采用有机无机肥配施真菌群落以子囊菌门、担子菌门与接合菌门为主；在本研究中,子囊菌门、担子菌门与被孢霉门为优势门,该结论和之前报道一致[42]。宋秀丽等[39]研究得出,和旋耕、深松不覆盖的处理相比,深松与覆盖处理之后有助于子囊菌门相对丰度大幅增加。靳玉婷等[43]在水稻-油菜轮作发现秸秆还田配施化肥土壤中子囊菌门和担子菌门真菌群落的相对丰度提高。本试验中,子囊菌门的相对丰度以秸秆覆盖不施氮处理最高和覆盖施氮处理最低,覆盖处理降低被孢霉门的相对丰度,担子菌门的相对丰度增加,说明担子菌门更适宜秸秆覆盖提供的生长环境。有研究表明[44],担子菌门是植物凋落物顽固性成分的主要分解者。因此,在秸秆覆盖条件下担子菌门的相对丰度增加更有利于秸秆的分解。前人研究表明[15,45],秸秆还田显著增加弯孢菌属、镰刀菌属、被孢霉属的相对丰度；而本研究中,秸秆覆盖增加了光盖伞属、弯孢菌属和黑孢霉属的相对丰度。光盖伞属、弯孢菌属和黑孢霉属具有降解木质素和纤维素的功能[46—48],说明此类真菌菌属在秸秆覆盖下相对丰度增加利于秸秆分解,促进养分释放。

4 结论