氮添加对乐山大佛裸露岩石与地衣覆盖岩石表面细菌群落结构的影响

陈旭黎,吴福佳,孙 博,杨天宇,宋会兴,*

1 四川农业大学风景园林学院, 成都 611130

2 中铁西北科学研究院有限公司,兰州 730000

3 乐山大佛景区管理委员会石窟研究中心,乐山 614003

氮是陆地生态系统最重要的营养元素之一,与碳、硫、磷等元素循环密切相关[1],氮缺乏/氮制约是岩石风化成土过程的普遍现象[2]。与森林生态系统氮元素的主要来源是动植物遗体的分解与腐烂不同[3],大气氮沉降[4]与生物固氮[5]是岩石表面微生境氮元素的主要来源。当前,大气氮沉降对陆地生态系统土壤细菌群落的影响已有许多报道[6—7],发现氮沉降增加可造成变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度增加的同时,降低酸菌门(Acidobacteria)和Verrucomicrobia的相对丰度,引起细菌群落结构及功能的转变；土壤细菌群落对氮沉降的响应动态随着地上植被的变化而变化[8]。现有研究多是以草原、森林等植被演替后期系统为对象,氮沉降对植被演替初期——岩石风化成土过程影响的信息较少。

岩石风化成土过程包括物理、化学和生物风化过程,而细菌群落在岩石风化初期可能发挥了主导作用[9]。细菌引起的岩石生物风化速率可达非生物风化速率的14倍以上[10]。研究认为,光合细菌(Photosynthetic Bacteria)利用光能将无机碳(CO2)同化为有机碳,在岩石表面沉积并富集,为裸露岩石表面包括需氧微生物、厌氧微生物在内的微生物群落的形成创造了养分条件[11]。微生物在生长代谢过程中产生的有机酸如甲酸、乳酸、葡萄糖酸、琥珀酸、柠檬酸等可以通过羟基和羧基产生不平衡的阳离子和阴离子加速岩石矿物的溶解速率[12],也可以通过羧基、羟基以及其它官能团螯合岩石析出的金属离子,影响岩石的稳定性[13]。近年来,有直接证据显示,细菌还能够以富含还原态铁的黄铁矿、黑云母、角闪石等为食物,通过亚铁离子的氧化还原过程获取能量,加速岩石的风化分解[14]。因此,研究不同风化阶段的岩石表面细菌群落变化对于理解岩石风化过程和机制具有重要意义。

乐山大佛是世界上最大的古代石刻弥勒佛坐像,始凿于唐开元初年(公元713年),历时90年建成,是唐代石刻艺术创作的代表作品,具有极高的历史价值、艺术价值与科学价值,于 1996 年12月与峨眉山自然保护区一起被联合国教科文组织列为“世界文化与自然遗产”。历经千余年的日晒雨淋,乐山大佛风化严重[15],藻菌共生体对乐山大佛砂岩风化的影响受到关注[16]。前期研究表明,藻菌共生体(地衣)覆盖的乐山大佛佛体表面与裸岩表面的土壤细菌群落明显不同[17]。石生地衣通过物理、化学以及生物化学等多种方式显著影响岩石基质,是岩石成土过程的重要环节,亦是石质文物保护面临的普遍问题[12]。中国亚热带地区是受氮沉降影响严重的区域[18]。因此,大气氮沉降是否影响乐山大佛佛体风化？过程与机制是什么？亟待深入研究。

1 研究区域概况

乐山大佛位于四川省乐山市,凿造在大渡河与岷江交汇处的凌云山栖鸾峰红砂岩上(29°32′47″N, 103°45′48″E),海拔354—435 m。地处亚热带湿润季风气候区,降水充沛,年均降水量约为1291.6 mm。降水主要集中于夏季,占全年降水的58%。年均蒸发量1057 mm,相对湿度达81%。大佛周围植被类型为亚热带常绿阔叶林,以栲属(Castanopsisspp.)、青冈属(Cyclobalanopsisspp.)和木荷属(Schimasuperba)为主。

2 研究方法

2.1 试验设计与大气氮沉降模拟处理

选择与乐山大佛佛体岩性、风化现状一致的红砂岩裸露的岩石(NR)和地衣覆盖的岩石(LR)为处理对象进行氮沉降模拟。基于四川盆地氮沉降特征[19],以全年实际氮湿沉降量的2倍值为最大预测值,按照成倍递减的方式设置氮添加量,以NH4NO3为氮源,设置5个处理梯度,依次为0 kg hm-2a-1(N0,对照)、9 kg hm-2a-1(N1)、18 kg hm-2a-1(N2)、36 kg hm-2a-1(N3,实际值)、72 kg hm-2a-1(N4),每一个氮处理浓度下均设置3个重复样方,共计30个处理样方,每个样方面积2×2 m2。

依据区域年降水量、月降水量分布分别计算各个样地需要喷洒的硝酸铵溶液浓度与喷施量。自2018年10月起,每月上旬选择晴朗天气使用手持式电动喷雾器完成对每个试验样地的喷洒处理。为避免样地间的相互影响,各样地间保留1.0 m以上的缓冲带。持续处理12个月。

2.2 样品采集

于2019年10月上旬完成采样。采用无菌刀从各样方多点采集40 g左右表土,均匀混合后装于无菌塑封袋内,每个处理样方采集1份样本,共计30个样本,均放入装有冰袋的采样箱当天运回实验室。每个样本均平均分为两份,一份自然风干,以供化学性质的测定,另一份在4 ℃环境中去除动植物残体、石砾等杂质,大块的样品捣碎,过2 mm筛,做好标记,保存于-80 ℃冰箱以供后续测序分析。

2.3 土壤化学性质测定

土壤样品经风干、研磨、去杂、过筛后,采用电位法(水土比2.5∶1)测定pH(PHS- 3C, LEICI, Shanghai, China)；采用K2Cr2O7-H2SO4氧化、FeSO4滴定法测定土壤总有机碳(TOC)含量；采用浓硫酸消煮、凯氏定氮法测定全氮(TN)含量(KND, Top Ltd., Hangzhou, Zhejiang, China)；全磷(TP)含量采用HClO4-H2SO4氧化、钼锑抗比色法测定[20]。

2.4 DNA提取和PCR扩增

根据E.Z.N.A.® soil DNA kit(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)说明书进行样本总DNA抽提,使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量,使用NanoDrop2000测定DNA 浓度和纯度。使用338F[21](5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3′)和806R[22](5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)对16S rRNA基因V3-V4可变区进行 PCR 扩增。

2.5 Illumina MiSeq测序和生物信息学分析

将同一样本的聚合酶链反应(PCR)产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)进行回收产物纯化,2%琼脂糖凝胶电泳检测,并用QuantusTMFluorometer(Promega, USA)对回收产物进行检测定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行建库。利用Illumina Miseq PE300(Illumina, CA, USA)平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。

原始数据经过质控过滤以及序列校正后得到优化序列。在NR和LR风化阶段,分别共得到863654和925088条高质量细菌Illumina测序序列；每个样本分别平均获得57577和61673条序列。使用UPARSE[23]软件(http://drive5.com/uparse/,version 7.1)对每个操作分类单元(OTU)进行去重、聚类和嵌合体检测并按照97%相似性[23—24]对非重复序列进行OTU聚类,从而得到OTU的代表序列。利用RDP classifier[25](http://rdp.cme.msu.edu/,version 2.2)对每条序列进行物种分类注释,并根据Silva 16S rRNA数据库进行比对,设置比对置信度阈值为70%。

2.6 数据处理与分析

采用mothur (Version v.1.30.1)计算细菌α-多样性Sobs和Shannon指数。采用SPSS(Version 20.0, IBM, New York, NY, USA)软件,利用单因素方差分析和student′s t-检验比较不同施氮处理间的差异显著性(P<0.05)；采用双因素方差分析研究了风化阶段和氮添加及其相互作用对土壤化学性质和细菌多样性指数的影响；使用Origin 2019软件进行图形绘制。采用QIIME和Bray-Curtis距离矩阵对细菌β-多样性进行主坐标分析(PCoA),并通过相似性分析(ANOSIM)检验不同组间细菌群落的差异,利用R语言(Version 3.2.3)绘制PCoA图。利用LEfSe[26]软件进行线性判别和效应量分析。

3 研究结果

3.1 氮添加对裸岩和地衣覆盖岩石表面土壤化学性质的影响

研究结果表明,风化阶段对土壤TOC含量有显著影响(P<0.001),地衣覆盖的岩石表面土壤TOC含量在不同施氮水平下均高于裸岩,但氮添加对土壤TOC含量影响不显著(表1,图1)。风化阶段和氮添加均对土壤TN和TP含量有显著影响(P<0.01),地衣覆盖的岩石表面土壤TN和TP含量均高于裸岩,且氮添加增加了裸岩和地衣覆盖的岩石表面土壤TN和TP含量(表1,图1)。风化阶段对土壤pH值无显著影响,但氮添加对土壤pH值影响显著(P<0.001),且裸岩和地衣覆盖的岩石表面土壤pH值均随着施氮浓度的增加呈降低趋势(表1,图1)。

表1 不同风化阶段和氮添加处理及其交互作用对土壤化学性质和细菌α-多样性指数影响的双因素方差分析

图1 不同氮添加处理对NR和LR土壤化学性质的影响

3.2 氮添加对岩石表面细菌群落α-多样性的影响

在裸露的岩石表面,氮添加对细菌的丰富度指数和多样性指数均无显著性影响(图2)。在地衣覆盖的岩石表面,N4、N3和N2处理均显著降低了Sobs指数值(图2)。

图2 不同氮添加处理对NR和LR细菌α-多样性的影响

3.3 氮添加对细菌群落β-多样性的影响

对裸岩和地衣覆盖岩石表面细菌群落的β-多样性分析结果表明,氮沉降对裸岩和地衣覆盖的岩石细菌物种组成均有显著影响(NR:P=0.002; LR:P=0.001)(图3),且对地衣覆盖的岩石细菌群落组成差异的影响大于裸岩(LR:R=0.822 ; NR:R=0.464)。基于Bray-curtis距离算法的PCoA分析结果显示,在裸岩表面,PC1和 PC2轴共解释了细菌群落OTU信息的44.60%；与对照相比,低氮处理(N1—N3)显著改变了裸岩表面细菌群落组成,且高氮(N4)处理与低氮处理对细菌群落组成的影响不同(R=0.464;P=0.002)(图3)。在地衣覆盖的岩石表面,PC1和 PC2轴共解释了细菌群落OTU信息的68.12%；细菌群落在不同氮添加(N0—N4)处理下均发生了明显变化(R=0.822;P=0.001)(图3)。

图3 基于NR和LR细菌物种组成的主坐标(PCoA)分析

3.4 氮添加对细菌群落物种组成的影响

裸岩表面的优势菌群以变形菌门(Proteobacteria)(36.75%)和放线菌门(Actinobacteria)(18.55%)为主,其次为绿弯菌门(Chloroflexi)(11.44%)、厚壁菌门(Firmicutes)(10.75%)、酸杆菌门(Acidobacteria)(6.13%)、WPS- 2(4.54%)、Patescibacteria(3.76%)、浮霉菌门(Planctomycetes)(3.53%)和拟杆菌门(Bacteroidetes)(1.42%)。地衣覆盖的岩石表面是优势菌群为放线菌门(32.07%)和变形菌门(29.66%),其次是绿弯菌门(14.98%)、WPS- 2(7.46%)、酸杆菌门(7.33%)、浮霉菌门(2.95%)、Patescibacteria(2.70%)、厚壁菌门(1.16%)和拟杆菌门(0.38%)(表2)。

在裸岩表面,变形菌门、放线菌门和Patescibacteria的相对丰度在氮添加处理后发生显著变化：与对照相比,变形菌门的相对丰度在N4处理下显著下降；放线菌门和Patescibacteria的相对丰度分别在N2和N3处理下显著增加(表2)。

在地衣覆盖的岩石表面,除了绿弯菌门,主要细菌类群在各氮添加处理中均与对照产生显著性差异。放线菌门与拟杆菌门相对丰度随氮添加量的增大而下降：N2处理时放线菌门相对丰度显著低于对照；拟杆菌门相对丰度在N1处理时与对照有着显著差异。变形菌门、WPS- 2、酸杆菌门、浮霉菌门、Patescibacteria和厚壁菌门在氮添加后均呈增加趋势：变形菌门和WPS- 2相对丰度趋势一致,在氮添加后呈上升趋势,N4处理显著高于对照；酸杆菌门和浮霉菌门的相对丰度则在N3处理时显著高于对照；Patescibacteria的相对丰度则在N1、N3和N4处理中均显著高于对照；厚壁菌门在N2 、N3和N4处理中显著高于对照(表2)。

表2 不同氮添加处理下门分类水平上各物种的相对丰度(平均值±标准差)

线性判别效应量分析(LEfSe)分析可识别不同氮添加处理下具有统计学差异不同分类水平的细菌类群,并通过张性判别分析(LDA)估算差异类群对组间响应的大小,从而筛选出不同分组间的生物标记物(Biomarker)。分析结果表明,不同氮添加处理组间的微生物类群存在显著差异(LDA>4；P<0.05)。通过进化分支图(Cladogram)分析(图4)发现,在裸岩表面,N2和N4处理下出现了指示细菌类群：N2处理的指示类群来自同一个分支,包括o_Rhizobiales、f_Rhizobiaceae和g_unclassified_f_Rhizobiaceae；N4处理的指示类群来自两个分支：一个分支包括o_IMCC26256、f_norank_o_IMCC26256、g_norank_f_norank_o_IMCC26256,另一个分支的指示细菌为g_Chujaibacter。

在地衣覆盖岩石表面,对照组与氮添加处理组均出现了相应的细菌指示类群(图4)。N0处理的指示类群来自两个分支：一个分支包括p_Actinobacteria、c_Actinobacteria、o_Pseudonocardiales、f_Pseudonocardiaceae和g_Crossiella,另一个分支为o_Frankiales；N1处理的指示细菌为g_Endobacter；N2处理的指示类群来自同一个分支,分别为o_Corynebacteriales、f_Mycobacteriaceae和g_Mycobacterium；N3处理下的指示类群来自5个分支,第一分支的主要指示细菌为o_IMCC26256,第二分支为c_Gammaproteobacteria,第三分支为g_norank_f_Acidobacteriaceae_Subgroup_1,第四分支主要包括p_Patescibacteria、c_Saccharimonadia和o_Saccharimonadales,第五分支主要包括o_Gemmatales和f_Gemmataceae；N4处理的指示类群主要来自两个分支,其中一个分支主要包括o_Acetobacterales和f_Acetobacteraceae,另一分支包括o_Xanthomonadales、f_Rhodanobacteraceae和g_Chujaibacter。

图4 不同氮添加水平下细菌各分类水平物种的线性判别效应量分析(LEfSe)分析

4 讨论

化石燃料的消费,交通、工业与生活垃圾排放的增加,均加剧了空气污染,尤其是含氮化合物的增多(例如NH3、 NO2和NO)[27]。含氮化合物与水蒸气相互作用,沉积于岩石表面,影响岩石表面的生态过程[28]。本研究发现,大气氮沉降对乐山大佛裸岩与地衣覆盖岩石表面土壤细菌群落产生了不同的影响。

4.1 氮添加对细菌群落多样性的影响

氮添加影响了地衣覆盖岩石表面土壤细菌群落的α-多样性(图2)。通常认为,低浓度的氮添加增加土壤有效氮含量,提升植物的净初级生产力[29],导致进入土壤的凋落物与根系沉积物增多,促进微生物群落的丰度和多样性[30]。土壤细菌群落Shannon指数在低氮(N1)添加时的增加可能是增加了岩石表面附生细菌养分来源的原因[31]。在高氮添加(N4)时,细菌群落α-多样性低于对照,这一方面可能是由于氮添加改变了表层土壤氮的有效性,促进地上植物对养分的需求,导致地下微生物养分的获取受到限制,从而抑制微生物生长[32]。另一方面,细菌群落丰度的降低还与高氮输入造成的土壤pH降低有关(图1)。土壤pH降低可诱发土壤微生物的铝毒性[33],从而降低土壤细菌群落的丰富度[34]。

然而,氮添加对裸岩表面细菌群落的多样性和丰富度均没有产生显著性影响(图2)。在裸露的岩石表面,植被缺乏使得碳输入增加的可能性极小,这使得地衣覆盖的岩石表面土壤TOC含量高于裸岩(图1)。这进一步证实了氮添加对土壤微生物的影响与土壤中碳含量有关[35]：当土壤碳充足时,添加氮会显著促进土壤微生物的生长。相较于地衣覆盖的岩石,裸岩缺少有机碳输入途径,即使氮沉降增加,也难以形成或促进系统内部生态循坏,从而不会对微生物的多样性产生显著性影响。此外,裸岩缺乏生物体的覆盖,基质对额外输入的氮保留能力弱,绝大部分氮淋失,这也是导致裸岩表面细菌多样性对氮添加响应不显著的原因之一。

4.2 氮沉降对细菌群落组成的影响

岩石的风化成土过程(原生演替)受到立地生物条件(基质、气候和地形)和生物因素(植物物种 、到达顺序以及种间相互作用等)的影响[36]。在佛体表面,即使开凿时间一致,也因为微地形等因素造成乐山大佛不同部位岩石风化程度不同。尽管缺乏维管植物发达的根系和根系介导的微生物群落效应,但地衣的存在会影响岩石/基质温度、湿度以及碳氮有效性[37],对微生物群落产生有利或不利的影响,地衣覆盖的乐山大佛岩石表面土壤细菌群落与裸岩表面有着显著的不同[17]。此外,裸岩生境中细菌养分来源更多依赖于风吹、远古或者微生物固定来源的碳和氮[38]。这种养分供给的偶然性和不确定性,也是裸岩与地衣覆盖岩石表面细菌群落对大气氮添加不同响应的原因(图3)。

4.3 氮沉降对岩石风化过程的潜在影响

石质文物风化过程与石质文物表面微生物群落结构、丰度和多样性直接相关[46—47]。尽管氮添加对乐山大佛裸岩表面细菌群落的α-多样性没有产生显著性影响,但放线菌相对丰度在氮添加后显著增加(表2)。放线菌是石质文物生物腐蚀研究中经常提及的类群,它们在岩石表面形成白色生物膜,产生水溶性深色染料,对文物色彩及结构造成损伤[48—49]。大气氮沉降对放线菌的影响预示着乐山大佛裸露岩石在未来气候条件下面临更严重的生物风化影响。在地衣覆盖岩石表面,细菌群落α-多样性指数在氮添加后呈降低趋势,但变形菌门、WPS- 2、酸杆菌门、浮霉菌门、Patescibacteria和厚壁菌门的相对丰度在氮添加后显著增加(表2)。厚壁菌门是影响砖石风化的重要微生物类群[46]；隶属厚壁菌门的芽孢杆菌属(Bacillus)通过产生自乳化活性酸和表面活性剂,具有加速岩石降解的能力[49]。微生物对文化遗产的降解能力除了与遗传多样性相关外,还取决于它们形成生物膜的能力[47]。变形菌门物种通过合成有机化合物促进岩石表面生物膜的形成与发展,造成文化遗产材料的微生物退化[50]。此外,真菌是地衣的组成部分,细菌与真菌在氮添加后通过建立相互联系的动态群落和生物膜系统以适应和抵抗外界恶劣环境,促进群落的生存和演替,从而进一步增加石质文物的风化风险。

5 结论

通过氮添加模拟实验,对乐山大佛裸岩与地衣覆盖岩石表面土壤细菌群落响应未来大气氮沉降特征进行了研究。大气氮沉降对乐山大佛裸岩和地衣覆盖的岩石表面细菌群落组成均产生了显著影响。相较于裸岩,地衣覆盖的乐山大佛岩石细菌群落受氮沉降的影响更显著；在不同的岩石表面,即使是同一类群对氮添加的响应趋势也并非完全相同；线性判别和效应量分析分别发现了裸岩和地衣覆盖岩石表面7个和21个在氮添加后的细菌指示类群。研究结果暗示,地衣覆盖的岩石在未来气候变化中受到环境的影响较裸岩更大。由于菌群功能信息的不足,未来氮沉降对乐山大佛文物风化的影响趋势尚需进一步的研究。