骨髓增殖性肿瘤非驱动基因突变对疾病表型的影响

赵越，苏雁华，高玉娟，许鑫

作者单位：哈尔滨医科大学附属第一医院血液内科，黑龙江 哈尔滨 150001

骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN）是由造血干细胞和祖细胞的体细胞突变驱动的血液系统疾病。JAK-STAT通路在MPN的发病机制中起着核心作用。经典MPN的遗传基础已被广泛研究，超过95%的真性红细胞增多症（polycythemia vera，PV）病人以及超过50%的原发性血小板增多症（essential thrombocythemia，ET）和原发性骨髓纤维化（primary myelofibrosis，PMF）病人存在Janus激酶2（JAK2）的单个氨基酸突变，称为JAK2V617F突变，该突变存在于0.1%的个体中，并且与MPN的发展密切相关［1-2］。在大多数JAK2V617F阴性PV病人中，JAK2基因第12外显子的突变也被确定为疾病驱动因素［3］。CALR突变（calreticulin gene mutation）是继JAK2V617F之后的第二常见突变，在ET和PMF病人中占25%～35%［4］。血小板生成素受体（MPL）突变是另一个占ET和PMF的3%～5%的主要疾病驱动因素［5］。这三种突变几乎以互斥的方式发生，很少有共同发生的报道［6-7］。三个突变都不携带的病人是多克隆的，被分类为“三阴性”病人［8］。除了JAK2，CALR和MPL突变外，一些非驱动突变也会导致MPN表型和疾病异质性。尽管它们中的大多数不是特定发生于MPN，但这些突变被认为在MPN发育的不同阶段起作用，包括克隆性造血的启动，疾病进展为继发性骨髓纤维化和白血病转化。

1 DNA甲基化修饰剂

TET2（TET oncogene family member 2）突变是最常见的非表型驱动程序突变，在多达22%的MPN中存在，在PV中突变频率大约为16%，ET中5%，PMF中17%，PV后MF中14%，ET后MF中 的14%和MPN急 变 期（MPN in blast phase，MPN-BP）的17%［9］。TET2通过将5-甲基胞嘧啶（5mC）氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）在DNA甲基化中起关键作用。正常TET2功能的丧失会降低5hmC的产生，导致DNA超甲基化。这对HSC增加自我更新基因标记的表达，使造血细胞对协同突变敏感并偏向骨髓单核细胞分化具有特殊作用［10］，并使造血细胞对协同突变敏感。François等［11］发现，染色体4q24的缺失或重排是TET2功能丧失的另一种机制，并进一步证实了该突变的早期分化及其与JAK2V617F突变的协同作用，但关于TET2突变及其是否影响转化为急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的 风 险 存 在 争 议［12］。在TET2突 变 之 前 获 得JAK2V617F突变的病人具有更严重的表型，与ET相比，被诊断为PV的可能性更大，并且患血栓形成的风险增加，在JAK2V617F之前出现的TET2倾向于ET表型［13］。比较单突变JAK2V617F诱导的MPN和双突变JAK2V617F和TET2突变型诱导的MPN的表型，JAK2V617F突变细胞受体的巨核细胞形成密集的簇，并且明显多于来自野生型细胞受体的巨核细胞，还显示出异常的核质比、小叶核。此外，双突变细胞不仅表现出JAK2V617F细胞受体的表型，而且还表现出白细胞增多，脾肿大和严重的髓外造血功能延长，总生存期略短。

DNMT3A（DNA methyl transferase3A）负责控制CpG二核苷酸处的DNA甲基化［14］，在不到10%的MPN中发现了此突变，DNMT3A在髓样恶性肿瘤中最常见的突变是一种错义突变，尤其是甲基转移酶结构域（R882）中的错义突变，导致酶活性降低和再次DNA甲基化［15-16］。在MPN的JAK2V617F阳性模型中使用CRISPR模型使DNMT3A功能丧失，会阻止红系增殖并引起骨髓内和肝内纤维化并浸润脾脏，还会导致异常的自我更新和炎症信号通路，以上结果确定了JAK2V617F驱动的MPN与DNMT3A丢失之间的致癌协同作用，从而激活了造血干/祖细胞增强剂驱动的炎症信号传导［17］。Guryanova等［18］也发现，DNMT3A功能丧失诱导体内成熟的骨髓和骨髓祖细胞扩增，脾脏增大并散在发育异常的巨核细胞，在DNMT3A缺失小鼠的骨髓中观察到了正常成人造血几乎不存在的cKit+，CD41+群体。

异柠檬酸脱氢酶1和2［Wild-type isocitrate dehydrogenase（NADP+）1 and 2，IDH1，IDH2］突变发生在少于5%的慢性期MPN中，但多数发生在20%至30%的MPN后AML病人中，突变发生在PMF较PV或ET更常见［19］。IDH突变体增加了2-羟基戊二酸酯（2-HG）的产生，从而阻止了组蛋白去甲基化。突变影响酶的活性催化位点中高度保守的精氨酸残基，并导致其肿瘤抑制活性丧失。McKenney等［20］证明了JAK2V617F和IDH突变的协同作用，与单独出现JAK2或IDH突变体相比，IDH1R132H和IDH2R140Q模型与JAK2V617F共同突变时表达更高的血清2-HG水平。与大多数后期分化祖细胞相比，突变的组合显示出分化受损和未成熟祖细胞增加。用JAK2抑制治疗不能显著逆转该表型，但通过联合抑制JAK2和IDH2，双重突变细胞恢复为更接近正常化的细胞，需要进一步研究以充分评估IDH突变在MPN后AML中的生物学作用。LT中IDH突变的存在使总生存期比非IDH突变的白血病要差，IDH突变的患病率较高，为12.5%～26%多项研究也显示在获得IDH突变后发生白血病转化的风险更高［21，29］。

2 染色质修饰剂

性 梳 样 蛋 白1（additional sex combs-like 1，ASXL1）对同源基因的表达具有沉默和增强作用。它通过多梳阻遏物复合物2（PRC2）增强组蛋白标记的甲基化，从而导致染色质重塑基因（如HOXA）的抑制和沉默，影响组蛋白的翻译、修饰，起到抑制癌症的作用［22-23］，在PMF（18%～37%）和MPN后AML（17%～47%）中更为常见，并且与PV和PMF病人的预后不良相关［24］；EZH2（Enhancer of zeste homolog 2）编码组蛋白甲基转移酶，该组蛋白构成PRC2功能的催化成分，以启动基因的表观遗传沉默［25］，二者均是多梳阻遏复合物甲基化组蛋白调节染色质结构的一部分。但是，ASXL1的作用比EZH2更为广泛，ASXL1可以通过与去泛素化酶（DUB）BRCA-1相关蛋白（BAP1）结合而参与PRC1复合物的形成，该蛋白是实体瘤中的关键肿瘤抑制因子［26］。此外，ASXL1还与核激素受体结合，通过调节Hox基因在发育中起着重要作用。

在一项针对169例PMF病人接受同种异体干细胞移植后分子遗传学对其预后影响的研究发现，ASXL1和IDH2突变是降低无进展生存期（progression-free survival，PFS）的独立危险因素［27］。监测ASXL1突变的获得可能与MPN病人的管理有关，因为ASXL1突变是鲁索替尼治疗期间获得的最频繁的突变，并且与停药时白细胞增多和低血小板的发生有关［28］。在一项针对135例MPN病人二代测序与突变特征的研究显示，与具有JAK2或TET2突变的病人相比，具有ASXL1突变的PMF的病人有较高的AML转化率，特别是具有ASXL1突变的PMF可能比具有JAK2或TET2突变的PMF（分别为P=0.08和P=0.25）具有更高的转化为AML的风险［29］。

JAK2V617F和EZH2双重突变小鼠的表型与PRC2靶基因表达的变化相关，特别是Lin28b/let7/Hmga2轴的表达变化有关，Hmga2的过表达在该表型中起重要作用。多项研究证实EZH2和JAK2V617F双突变的存在加速MF发展并大大降低了存活率，伴随EZH2突变会减少红细胞生成，但增强JAK2V617F阳性小鼠中的巨核细胞表达［30-31］。

3 剪接体复合物

近几年在不同的造血系统恶性肿瘤中检测到了编码剪接体蛋白的基因突变，在MDS中更为多见［32］。MPN中的剪接体基因突变基本上仅限于ET和MF。最 常 见 的 突 变 包 括SRSF2、SF3B1和U2AF1，与贫血和血小板减少症相关。SRSF2编码一种蛋白质，1990年，Fu和Maniatis首先使用针对哺乳动物剪接体的单克隆抗体对其进行了识别。该蛋白质属于SR家族，它包含核糖核蛋白（RNP）型RNA结合基序和含羧基末端的结构域，与premRNA中的ESE序列结合。研究表明，在脯氨酸95（P95H）上的SRSF2突变可以优先识别CCNG ESE基序，野生型可识别CCNG和GGNG ESE基序，这种改变将会导致许多错配事件的发生，从而影响功能，并且增加了双链DNA断裂，p53过度磷酸化和过度乙酰化以及细胞周期停滞［33］。在小鼠造血细胞中也有类似的发现，其中SRSF2缺失的细胞具有生长停滞，早期衰老和凋亡特征［34］。SRSF2突变在多在8%～22%的PMF和MPN后AML中发生，并与骨髓恶性肿瘤的不良预后相关，包括多种类型的MPN和MPN后AML［35-36］。在另一项类似干预的研究中，SRSF2纯合敲除小鼠显示胸腺细胞损失70%～90%，CD4-/CD8-T细胞明显增加，而CD4+/CD8+T细胞减少。因此，SRSF2的缺失似乎会影响胸腺中T细胞的成熟，可能是继CD45剪接改变后继发的［37］。

小鼠模型中SRSF2 P95H的表达导致髓样偏倚，形态异常和单核细胞增多，以及造血干细胞数量减少，SRSF2的突变足以在自然造血的情况下启动MDS/MPN的 发 展［38］。MDS/MPN重 叠 综 合 征（MMOS）可在初始诊断期间同时具有MDS（外周血细胞减少和/或增生异常骨髓）和克隆增殖（白细胞增多，血小板增多或肝脾肿大）的临床和形态特征重叠［39］，SRSF2和U2AF1突变在PMF病人中的患病率分别为15%和22%，突变与预后不良有关［40］，但是在MMOS中，证据还不是很清楚。早期研究MMOS中SRSF2突变的研究报告，无论是CMML还是其他MDS/MPN重叠综合征，SRSF2突变对总体生存率（overall survival rate，OS）均无影响［41］。SRSF2突变与JAK2和MPL驱动程序突变结合似乎更常见，U2AF1突变占MPN慢性期的比例不到2%，与MPN白血病转化中5%～9%的进展有关［23］。

4 肿瘤抑制因子

肿瘤抑制基因TP53（Tumor protein P53）位于17号染色体上，编码一种DNA结合蛋白，该蛋白通过诱导转录程序对DNA损伤做出反应，从而导致细胞周期停滞或通过凋亡途径导致细胞死亡［42］。在大约40%～50%的MPN继发性白血病中发现了针对TP53肿瘤抑制功能的各种突变和细胞遗传学损伤。这通常包括TP53基因的错义突变或缺失或靶向TP53转录抑制剂MDM4的1q染色体的扩增［43］。

TP53突变在慢性MPN中并不常见，但易发生在11%～36%的MPN后AML病人中。除了较高的突变频率，与慢性期样本相比，来自MPN后AML病人样本中TP53突变的变异等位基因分数更高，表明TP53突变会导致MPN中的白血病转化。与野生型病人相比，携带TP53突变的MPN后AML病人的总生存期较差［44-45］。使用国际血液和骨髓移植研究中心数据库评估了177例MPN-BP病人的骨髓造血细胞移植（HCT）和二代测序结果，在多变量模型中，TP53突变病人的OS较差，复发率增加；细胞遗传学改变和TP53突变状态可预测MPN-BP中HCT的结果，而不是原始细胞减少。TP53突变的病人未观察到HCT有意义的益处［46］。一项关于二代测序分析对MPN相关内脏静脉血栓（MPN patients with splanchnic vein thromboses，MPN-SVT）病人预后影响的研究，JAK2V617F等位基因负荷≥50%或存在染色质/剪接体/TP53突变与不良的MPN-SVT血液学结果相关［47］。1q染色体的扩增或17p的缺失靶向MDM4（TP53转录抑制子）转录水平的提高，蛋白质MDM2和MDM4会抑制TP53转录功能，从而干扰了TP53通路，导致MPN进展［48］。

5 结语与展望

JAK2和程序性死亡配体1（PD-L1）基因均位于染色体9p24上，最近研究证明JAK2V617F突变小鼠的T细胞、巨核细胞和单核细胞中PD-L1表达增加，STAT3（信号转导和转录激活因子3）和STAT5与编码PD-L1的Cd247启动子结合，并明确指出STAT3是上调Cd247表达的主要机制。抗PD-1抗体治疗能够降低小鼠JAK2V617F等位基因负担，该作用依赖于完整的供体T细胞反应。这一实验初步奠定了PD-1/PD-L1作为骨髓增殖性肿瘤的潜在治疗靶标［49］。就目前而言，MPN-BP治愈或长期缓解的唯一希望仍然是ASCT，并且及早确定患有白血病转化高风险的MPN病人，以便他们可以更早地接受ASCT治疗。

激活JAK-STAT信号传导的MPN表型驱动程序突变是MPN发病机制的关键。具有表型驱动因子的克隆生长速度相对较慢，恶性克隆可能需要数十年的时间才能充分扩展以引起临床症状，这取决于影响生长速度的其他因素，包括生活方式，炎症和驱动程序突变的类型等。MPN-BP的预后不佳，甚至比原发性AML更差。单独的药物治疗虽然能够在少数病人中达到CR，但在长期缓解方面无效。

MPN病人常有复杂的分子特征，临床异质性主要与突变的组合以及突变基因的获得顺序有关。每个突变的确切作用及其对MPN表型的影响仍需要进一步研究。借助高通量DNA测序技术发现更多的非驱动基因突变并进行深入的分子遗传学研究，正越来越多地用于预测预后和评估疾病进展的风险。众多临床观察为临床试验基因靶向疗法和免疫疗法的应用提供了依据，特别是为无法耐受标准化疗的复发/难治性病人，未来应致力于研究降低PMF进展和白血病转化风险以及克服不良遗传风险特征的药物以改善MPN病人的生存率。