哺乳动物雷帕霉素靶蛋白与衰老相关机制的研究

杨玉露，黄芸

(华中科技大学同济医学院附属协和医院老年病科，武汉 430022)

衰老是自然界普遍存在、不可逆的生理功能逐渐退化的状态，也是一种多因素共同作用的结果，既与个体寿命有关，又与年龄相关性疾病的发生有关，如高血压、动脉粥样硬化、2型糖尿病、癌症、阿尔茨海默病、骨质疏松、白内障等[1]。衰老是一个不可逆转的自然规律，引起了人们的广泛关注。随着人口老龄化的发展，衰老和年龄相关性疾病已成为当今最重要的公共问题。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与许多重要的分子信号通路，是调控细胞生长网络的中心节点，其通过整合能量和营养的信息，协调细胞成分的合成或分解[2]。mTOR抑制剂的研究起源于20世纪60年代，当时研究者在智利拉帕努伊岛的土壤样本中发现一种新的抗菌活性物质，命名为雷帕霉素，又名西罗莫司，是大环内酯类化合物，具有强大的抗真菌活性[3]。近年来研究发现，抑制mTOR可以延长哺乳动物生命周期并预防和延缓年龄相关性疾病的发生[4-6]，这一发现激发了人们开发mTOR抑制剂作为延长人类寿命药物的兴趣。现对mTOR信号通路控制寿命和影响衰老的潜在机制进行综述，以期为延长寿命和治疗年龄相关性疾病提供新的靶点。

1 衰老机制

衰老是一种永久性的细胞周期停滞状态，按其机制可分为复制性衰老和应激性衰老。其中复制性衰老由细胞分裂导致的端粒损伤引起，端粒是染色体末端具有保护作用的DNA-蛋白质复合体，在细胞多次分裂增殖过程中不断缩短，当其长度临界最小值时，即引发DNA损伤反应。而应激性衰老往往不伴随端粒长度的缩短或功能的丧失，而是由氧化应激、癌基因激活、肿瘤抑制因子缺失等因素导致[7]。衰老细胞具有复杂的表型，如DNA损伤、细胞周期停滞、分泌相关因子、代谢异常、形态改变等，同时，细胞衰老也受到机体多重机制的调节[8]。mTOR是细胞生长代谢调节的核心环节，参与细胞生长、增殖、存活、运动、自噬和蛋白合成，也参与细胞衰老的调节[9]。虽然胚胎期mTOR信号激活有利于胚胎生长发育，但当生长发育完成后，mTOR信号的过度激活会驱动衰老，导致与年龄相关的疾病和死亡，通过基因或药物抑制mTOR可延缓衰老的发生[10-12]。

2 mTOR信号通路

mTOR是由FRAP1(FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein 1)单个基因编码，是一种进化上保守的非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶家族成员。mTOR主要通过两种不同的蛋白质复合体mTOR复合物(mTOR complex，mTORC)1和mTORC2行使其生理功能。其中mTORC1由3个核心成分构成，分别是mTOR、mTOR调节相关蛋白、哺乳动物致死因子半胱氨酸13蛋白8。而mTORC2主要由mTOR、雷帕霉素不敏感伴侣和哺乳动物致死因子半胱氨酸13蛋白8组成。mTORC1对雷帕霉素敏感，主要参与蛋白质的合成、细胞的生长增殖、核糖体及线粒体的生物合成、自噬及新陈代谢，而mTORC2对雷帕霉素不敏感，主要参与调控细胞存活，并控制细胞骨架结构和极性[13]。因目前关于mTORC2的研究有限，故本研究将主要围绕mTORC1展开。

2.1mTORC1的上游调控 mTORC1是细胞响应外界刺激、调节生长代谢和维持机体稳态的中心，其激活依赖于生长因子、能量状态和营养物质，其中结节性硬化症1/2复合体是参与调节mTORC1活性的最重要物质。生长因子(如胰岛素)可通过同源受体激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)，从而抑制结节性硬化症1/2复合体，而后者可激活GTP酶，进而激活溶酶体表面小GTP结合蛋白脑组织富含的Ras同源物，最终导致mTORC1激活。细胞的能量状态也是影响mTORC1活性的重要因素，在能量消耗或轻度缺氧条件下，细胞内ATP水平降低可激活促分裂原活化的蛋白激酶，并导致结节性硬化症1/2复合体磷酸化，抑制mTORC1活化[14]。环境中的营养物质，特别是亮氨酸和精氨酸，通过Rag亚家族Ras相关的小GTP酶与mTOR调节相关蛋白相互作用，促进mTORC1的溶酶体定位，从而使mTORC1被脑组织富含的Ras同源物激活[15]。

2.2mTORC1的下游调控 激活的mTORC1通过磷酸化两个关键的底物蛋白分子核糖体S6蛋白激酶1(S6 kinase 1，S6K1)和真核细胞始动因子4E结合蛋白1(4E binding protein 1，4EBP1)向下游传递信号[13]。一方面磷酸化的S6K1可进一步激活多种参与蛋白质翻译的蛋白因子，另一方面磷酸化的4EBP1与真核细胞起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)解离，启动核糖体翻译过程，进而增加翻译效率和蛋白质合成数量[13]。此外，mTORC1还有许多下游效应物，如固醇调节元件结合蛋白、转录激活因子4、氨基甲酰磷酸合成酶、unc-51样自噬激活激酶1、转录因子EB，分别参与脂质合成、核苷酸代谢和自噬调节等重要的生理生化反应[16]。由此可见，mTORC1是细胞生长的正向调控因子，可激活合成代谢、抑制分解代谢，以满足细胞生长和增殖需要。

3 mTORC1调控衰老的机制

3.1蛋白质合成 蛋白质合成是细胞生长所必需的生化反应，受到mTORC1的严格调控。mTORC1通过磷酸化4EBP1和S6K1促进信使RNA翻译和蛋白质合成。在未磷酸化状态下，4EBP1与eIF4E结合，阻碍翻译的进行。经mTORC1磷酸化后，4EBP1与eIF4E分离，从而形成激活的eIF4E复合体，上调含5′端寡聚嘧啶的信使RNA的翻译。mTORC1结合、磷酸化激活核糖体S6K1，进而激活核糖体40S亚基S6蛋白，促进核糖体生物合成[2]。一般认为，衰老是一系列异常蛋白质累积的过程，其最常见的分子特征与错误合成或不正确的翻译修饰有关。抑制mTORC1的过度激活，减少异常蛋白质的合成，可在一定程度上延缓衰老的发生[17]。Selman等[18]发现，基因特异性敲除S6K1小鼠的寿命延长，且年龄相关性疾病的发生减少。肌少症是与年龄增加相关的进行性全身肌量减少、肌肉强度和功能下降而引起的综合征，Paturi等[19]采用蛋白质印迹法检测发现，老年大鼠的肌肉萎缩和缺失与参与蛋白质合成的蛋白磷酸化有关，包括Akt、mTOR、p70S6K和AMP活化的蛋白激酶，而且雄性大鼠表现这些差异似乎更为显著。小胶质细胞是大脑的免疫细胞在发育、稳态和损伤修复中发挥重要作用，而衰老小鼠的小胶质细胞中4EBP1和S6K1磷酸化水平上调，与蛋白质和炎症细胞因子增加相关[20]。由此可见，蛋白质合成增加是衰老的一种常见机制，可能构成重要的治疗靶点。

3.2自噬 自噬是由特定基因调控、依赖溶酶体的胞内降解途径，是一个高度调控和进化保守的分解代谢过程，与生长、发育、衰老、疾病状态等过程密切相关。自噬不是简单消除，而是作为一个动态系统，促进细胞更新并维持体内稳态[21]。自噬降解废弃或损坏的细胞成分，并将其回收为“备用的分子部件”，通过这个过程，老化的细胞得以清除损坏的蛋白质或细胞器，从而实现自我更新。激活的mTORC1通过调控多种自噬相关蛋白的磷酸化，如unc-51样自噬激活激酶1、抗T淋巴细胞球蛋白(anti-T-lymphocyte globulin，ATG)13、自噬调节因子和ATG14L，抑制自噬启动和自噬小体形成，从而抑制自噬。此外，溶酶体是完成自噬的必要条件，而转录因子EB是溶酶体和自噬基因表达的主要调控因子，mTORC1可磷酸化并阻止转录因子EB的核定位，从而在转录水平上抑制自噬[22]。有研究表明，自噬可能随着年龄的增长而下降，损伤的蛋白质和细胞器(如线粒体)积累导致健康受损、寿命缩短，与衰老相关疾病的发生和发展[23]。近年Shen等[24]研究发现，PADI4(peptidyl arginine deiminase type Ⅳ)通过介导Akt/mTOR信号通路，调控自噬相关蛋白表达，如ATG5、Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)BⅠ和LC3BⅡ，从而延缓阿尔茨海默病细胞衰老，保持细胞活性。中药成分肉豆蔻提取物通过激活Akt-mTOR通路，导致自噬中间物质p62增加和LC3BⅡ减少，从而防止衰老过程中骨骼肌质量的损失[25]。近年来，自噬引起了研究者的极大关注，人们普遍认为，自噬的调节和维持是生命周期中的主要变化的基础，mTOR抑制剂诱导并促进自噬过程在神经退行性病变及其他衰老相关疾病中起十分重要的作用。

3.3衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP) SASP是指衰老细胞具有表达和分泌多种细胞调节剂的能力，如细胞因子、趋化因子、蛋白酶、生长因子和生物活性脂质等[26]。SASP引起的炎症损伤可破坏细胞的正常结构和功能，是细胞功能独立的破坏因子和衰老的促进因子。核因子κB参与细胞对外界刺激的反应，在炎症反应、免疫应答过程中起重要作用，在衰老细胞中，多条信号通路汇合于核因子κB，进而激活多种促炎性细胞因子的基因表达，在这一复杂网络中，mTOR也扮演重要角色。Laberge等[27]的研究表明，mTOR可以选择性地增强膜结合细胞因子白细胞介素(interleukin，IL)-1A的翻译，直接调节SASP的生成，从而破坏组织并导致与年龄相关的病变。相反，mTOR抑制剂雷帕霉素抑制了IL-1A的翻译，降低了IL-6和其他细胞因子水平，可以改善衰老，并延缓年龄引起的炎症性疾病的进展。心血管并发症是肾移植患者死亡的高危因素，近年一项临床研究发现，mTOR抑制剂依维莫司可阻止细胞促炎性细胞因子的释放，延缓肾移植患者心血管老化[28]。Xia等[6]的研究发现，短期和长期雷帕霉素治疗均可使人牙龈成纤维细胞的IL-6和IL-8表达下降，进而增强其抗炎能力，从而延缓衰老的发生并调节衰老相关标志物的表达。SASP通过改变细胞微环境，导致细胞损伤和多种病理状态的发生，已成为调节衰老的重要手段之一，为肿瘤和年龄相关性疾病的治疗提供了新方向。

3.4细胞周期阻滞 衰老细胞区别于正常细胞最显著的特征为细胞周期停滞。正常的细胞增殖需要经历G1、S、G2、M期。随着细胞分裂次数的增加，端粒缩短，DNA损伤，多个检查点和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂被激活，细胞周期进程停止[29]。细胞周期蛋白与细胞周期蛋白依赖性激酶途径是公认的细胞周期调控机制，p53/p21和p16/pRB是目前研究最为广泛的分子靶点，且mTOR与上述途径密切相关。p53是一种常见的抑癌基因，mTOR在体内和体外均能提高p53的翻译速度，从而放大p53的激活。因此，mTOR的过度激活会导致应激条件下p53的大量积累并介导细胞周期停滞或凋亡[30]。在Tsc1基因缺陷的小鼠中，mTOR被异常激活，编码细胞周期抑制剂的信使RNA含量显著增加，包括p16、p19和p21，淋巴细胞生成相对减少，重建造血系统的能力受损，而雷帕霉素治疗可以有效逆转这一局面，并使其能够有效对抗病毒感染[31]。此外，Zhu等[32]研究发现，甲基苯丙胺可通过抑制mTOR信号上调p53和p21，诱导细胞周期阻滞，进而诱导肺泡上皮细胞衰老。辅酶Q10是线粒体氧化呼吸链的重要组成部分，可下调mTOR，减少细胞周期抑制因子p16、p21、p53的表达，从而延缓D-半乳糖诱导的间充质干细胞的衰老[33]。因此，在衰老过程中有许多调控蛋白通过mTOR对细胞周期进行调节，阻滞了正常的细胞周期，加速衰老进程。那么，如何合理利用这些调控蛋白延缓细胞衰老，值得进一步思考。

3.5干细胞活性 干细胞在参与组织修复和再生、维持正常组织稳态中发挥重要作用。干细胞数量和功能的下降可能是年龄相关组织稳态功能障碍的重要原因。有证据表明，mTOR在这一过程中起着核心作用，抑制mTOR可以保护甚至恢复多种组织中的干细胞功能[34]。如mTOR抑制剂雷帕霉素可增加肠道干细胞的数量和功能，促进干细胞的自我更新[35]。而神经干细胞中mTOR异常可导致大脑发育严重缺陷，如自闭症、癫痫发作、学习障碍和精神发育迟滞等。可见，mTOR及其下游信号分子在神经元和胶质细胞分化以及维持神经干细胞活性中发挥至关重要的作用[36]。尽管目前关于mTOR参与调控干细胞活性的研究正受到越来越多研究者的关注，但其具体分子机制尚未阐明，以miRNA为切入点不失为一种良好的尝试。Zhang等[37]的最新研究显示，经典的降糖药物二甲双胍可以通过AMP活化的蛋白激酶/mTOR信号通路下调miR-34a-3p，进而缓解牙髓干细胞的衰老，有望为牙组织再生补充天然种子细胞，具有巨大临床应用潜能。然而，Romine等[38]的研究发现，随着年龄的增长，海马体中神经干细胞的数量显著减少，使用氯胺酮短暂激活mTOR后可促进神经发生，减轻衰老大脑的认知能力下降；Ramalingam等[39]的研究发现，mTOR抑制剂雷帕霉素对放化疗引起的骨髓抑制有不良影响，甚至造成造血系统的严重缺陷，与多数研究的结论相反，可能与mTOR的激活时间和药物剂量以及机体功能状态有一定关联。总之，在评估mTOR抑制剂对老年群体的疗效时，必须仔细考虑其潜在毒性。

3.6氧化应激 许多研究表明，氧化和抗氧化机制之间的不平衡引起的氧化损伤是衰老过程中的一个关键因素[40]。活性氧是细胞氧化磷酸化代谢的副产物，细胞衰老过程中活性氧的主要来源是线粒体，由于线粒体功能障碍，细胞内活性氧水平急剧升高，导致DNA损伤[41]。mTOR可通过转录因子(YY1)-过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α控制线粒体氧化功能，以调节能量代谢，维持机体稳态[42]。mTOR还可通过促进谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基的信使RNA及蛋白质表达，提高细胞内还原型谷胱甘肽的合成速度，进而维持细胞内氧化还原平衡[43]。然而，氧化应激和mTOR信号之间的相互作用极其复杂，mTOR不仅调节氧化应激，而且受氧化应激的反馈影响。有研究发现，mTOR信号与氧化应激直接或间接的相互作用，对糖尿病缺血再灌注心脏既有保护作用又有毒性作用，一方面，mTOR可增强线粒体清除功能，保护心肌免受氧化应激诱导的细胞毒性损伤；另一方面，活性氧的产生又反过来激活mTOR，进而抑制自噬，减弱细胞对毒性物质的清除能力[44]。在临床上，氧化应激与多种疾病均密切相关，故缺乏特异性，因此，针对不同的年龄相关性疾病，选用不同的具有代表性生物学标志物对指导临床评价具有重要意义。

4 小 结

生物体的衰老是细胞衰老累积的结果，也是一个极其复杂的病理生理过程。近年来，人们致力于研究mTOR与机体衰老的内在联系，发现mTOR调控的多个细胞代谢过程似乎以重叠但协调的方式延长寿命，延缓衰老。衰老细胞存在形态改变、增殖能力丧失、衰老相关β-半乳糖苷酶活性增加、DNA损伤反应的激活以及细胞周期抑制物的水平增高等变化，但其衰老表型存在异质性，故没有一个单独的标记可以在体外和体内可靠地识别衰老细胞[45]。因此如何准确地评估衰老，以及如何恰当抑制mTOR信号从而延缓细胞或器官老化，仍是当今医学界靶向治疗的难点和热点。所以，针对mTOR作用靶点，深入研究mTOR信号通路在衰老发生发展中的作用机制，研发新型抗衰老药物，明确mTOR在年龄相关性疾病中的作用，对于减少年龄相关性疾病的发生、延缓衰老、延长个体寿命具有重要意义。尽管目前不良反应的出现阻止了其在健康个体中的应用，但随着研究的进一步深入以及精准医学的发展，靶向mTOR途径的药物可能会广泛用于减缓人类衰老和减少年龄相关性疾病的发生。