牙髓干细胞多项分化潜能的研究及应用进展

夏亮，江文欣，邹多宏

(1.上海交通大学医学院附属第九人民医院 a.口腔颅颌面科，b.口腔外科，上海 200011; 2.上海交通大学口腔医学院，国家口腔医学中心，国家口腔疾病临床医学研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海 200011; 3.上海交通大学医学院附属仁济医院口腔科，上海 200011)

干细胞被定义为可产生一种或多种特殊细胞类型的具有克隆性、自我更新性的原始细胞，在组织发育、维持稳态和修复受损组织等过程中均发挥重要作用[1]。干细胞分为三大类：多能诱导干细胞、胚胎干细胞和成体干细胞。其中，成体干细胞包括间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)、造血干细胞、表皮干细胞、脂肪干细胞、神经干细胞、角膜缘干细胞和肝干细胞等[2-8]。

MSC是具有多项分化潜能的多能细胞[9]，存在于成人骨髓基质中，为纺锤形的成纤维细胞样细胞，具有复制为未分化细胞的能力，并且能够进一步分化为多种间充质来源的组织，包括肌肉、肌腱、脂肪、软骨、骨和骨髓基质等[9]。除骨髓外，从脂肪组织和脐带血中也可以获得类似MSC的种群[10-11]。脂肪组织和骨髓是最容易获得MSC的来源，具有相对丰富的祖细胞[12]。骨髓MSC可改善组织损伤，具有改善肺损伤、肾脏疾病、糖尿病、心肌梗死、肝损伤和神经系统疾病的功能。然而，与脂肪MSC相比，骨髓MSC具有更高的分化成软骨和成骨谱系的能力[12]。此外，MSC还具有肌源性、神经源性和腱源性谱系分化的能力。随着对MSC研究的不断深入，在人体的每个器官和组织中都发现了多种干细胞，其中包括来自口腔和牙齿组织的MSC[13]。研究发现，牙源性MSC同样具有成骨、成软骨、成脂、成神经等分化潜能，并且具有更强的牙源性分化潜能。现就牙源性MSC的特性及其在牙齿、骨骼、软骨、脂肪和神经再生中的分化潜力和组织工程应用前景进行综述。

1 牙髓干细胞多项分化潜能

2000年，Gronthos等[14]首次报道从第三磨牙的牙髓组织中分离和鉴定出了MSC，即牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC)。目前，研究人员已能通过不同的口腔组织干细胞，如人脱落乳牙干细胞、牙周膜干细胞、牙滤泡祖细胞、顶端乳头和牙龈组织MSC等[13]，获得各类MSC种群。口腔MSC具有体外多能性，它们可以向多种细胞群分化，如成牙本质细胞、成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、成纤维细胞、神经细胞、脂肪细胞和内皮细胞等[15]。

牙髓是一种非矿化组织，由结缔组织、血管淋巴和神经组成，位于牙齿中央的髓腔。牙髓含有不同类型的细胞，包括成牙本质细胞、成纤维细胞、成骨细胞、破骨细胞、神经元和内皮细胞[16]。DPSC是外胚层衍生的干细胞，起源于神经嵴，从胚胎第6周起外胚层和外胚间充质相互作用开始形成牙齿，在这个过程中部分原始的MSC包裹在牙髓的前期结构内，这些是DPSC的来源。DPSC具有MSC特性，形态似成纤维细胞，可黏附于塑料表面，体外培养时可形成集落。DPSC表达间充质标志物，如CD29、CD44、CD59、CD73、CD90、CD146等，而不表达CD34、CD45、CD11b等造血标志物[15]。DPSC与骨髓MSC的性质相似，表达与矿化相关的表面标志物和基质蛋白，包括碱性磷酸酯、骨钙蛋白和骨桥蛋白等[17]。与骨骼不同，牙齿组织不会经历持续性的重塑过程，因此DPSC较骨髓MSC具有更大的分化潜能[13]。

DPSC具有多谱系分化的潜能，在适当的诱导条件下，可以分化为成牙本质细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经样细胞[16]。Alge等[18]研究比较了DPSC和骨髓MSC的克隆形成、增殖率、集落形成和矿化潜能，结果显示，DPSC具有更高的增殖速率、更强的克隆形成、更多的干细胞表型表达及更高的矿化潜能。

1.1DPSC成骨分化 先天性和获得性骨缺损的修复是再生医学研究的重点。近年来，利用骨髓干细胞治疗骨组织缺损已成为研究热点并取得了突破性进展[19]。DPSC作为牙源性的MSC，具有与骨髓MSC相似的增殖和分化潜能，在特定刺激条件下增殖并定向分化为骨组织。

在培养基中加入抗坏血酸、地塞米松、β-甘油磷酸和胎牛血清，可诱导DPSC的成骨分化，DPSC分化形成的成骨细胞在表型和功能上与正常原代成骨细胞相似[20]。经过成骨诱导后，DPSC中Runt相关转录因子2 和锌指转录因子表达显著增加，产生细胞外钙化的骨样基质结节，这些骨基质样结节碱性磷酸酶和茜素红染色呈阳性，说明DPSC经过诱导可以有效地分化为功能性成骨细胞，并生成钙化的含羟基磷灰石的细胞外基质[17]。近年来，学者们基于动物实验模型和生物支架材料对DPSC的骨再生应用潜能进行了广泛的研究。将DPSC进行骨诱导后获得的编织骨，异位移植到免疫功能缺陷动物模型中，能够诱导生成具有完整血液供应的成熟骨组织[21]。同时，有效地使用支架材料可以优化所形成的骨组织的3D结构并增强DPSC的成骨细胞分化。目前，多种材料已成功地用作DPSC成骨诱导的载体，包括3D明胶支架、自组装可生物降解的肽纳米纤维水凝胶、磷酸钙/聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架、颗粒状羟基磷灰石/磷酸三钙陶瓷支架、天然支架(如生物珊瑚)和壳聚糖/胶原蛋白等[20]。在国外的临床研究中，7例患者使用了胶原蛋白支架移植DPSC修复下颌骨缺损，经过术后3年的随访，获得了明显的治疗效果[22]。

有效的信号转导在刺激新骨形成和发育中起着至关重要的作用。有效获取和局部递送自体血浆生长因子为增强DPSC骨诱导和骨再生提供了一种强大的工具。富血小板血浆、富血小板纤维蛋白和富血浆生长因子为刺激和功能分化具有再生潜能的原代DPSC提供了生物因子富集型培养基，研究发现富血小板血浆和富血浆生长因子可以成功诱导人脱落乳牙干细胞、DPSC和牙周膜干细胞增殖，并增强其成骨分化[23]。另外，研究表明重组人骨形态发生蛋白2可以增强DPSC在牙槽突骨缺损动物模型中的成骨分化，目前重组人骨形态发生蛋白2已获批准并已广泛用于牙科手术的上颌窦提升手术[24]。尽管有大量的证据证实了基于DPSC的骨再生新型技术的效果，但由于不断变化的监管框架、标准化干细胞生产规范的缺乏、学术研究与工业生产的衔接不足以及缺乏长期临床随访等问题，DPSC作为骨再生的组织工程工具应用于临床仍存在许多阻碍。

1.2DPSC牙源性分化 50%的牙齿缺失是由于龋齿和根折导致。目前，根管治疗和修复是治疗牙髓炎症和重建缺损牙体组织最主要的治疗手段。然而，由于根管治疗后牙齿丧失了牙髓神经和血管的滋养，根折和牙齿丧失的可能性大大增加，牙髓损伤的再生修复已成为功能性牙齿恢复的目标。

Gronthos等[14]在2000年首次证明了DPSC分化为成牙本质细胞的能力，将DPSC复合的羟基磷灰石/磷酸三钙支架移植到免疫缺陷鼠的真皮下，可以形成牙髓样组织和成牙本质细胞样管状牙本质，表明牙本质发生分化是在DPSC表型中建立的主要或默认程序之一。将人脱落乳牙干细胞中提取的DPSC利用可注射支架材料重组胶原注入牙髓腔，不仅可以保持生命活性，还能够重建血管化的牙髓组织，并具有分化为成牙本质细胞的能力，这些细胞可以表达新的牙本质涎磷蛋白和牙本质基质蛋白[25]。结合脐静脉内皮细胞的DPSC与重组胶原支架复合，可以进一步增强牙髓样组织的血管化和血管生成[26]。

无牙髓牙齿的牙髓再生疗法是目前研究的关注重点，通过组织工程学方法进行牙髓再生的治疗正在进行广泛的临床试验研究，目前仍存在许多问题，包括牙髓再生的时间过长、支架材料的使用增加了炎症和感染的风险等。DPSC无支架3D细胞构建体建立的新颖牙髓再生疗法技术避免了支架材料在移植牙髓样组织中造成的潜在问题。Itoh等[25]通过体外和体内实验分别评估了3D DPSC构建体用于牙髓再生的可行性。体外研究中，通过用热响应性水凝胶成型DPSC的片状聚集体来获得3D DPSC构建体，经过长时间的培养，构建物中的DPSC仍然能够保持活性，且该3D DPSC构建体具有充当移植组织所必需的自组织能力。在人牙根管中填充3D DPSC构建体并将其植入免疫缺陷小鼠的皮下6周后，根管内形成了具有丰富血管的牙髓样组织[25]。组织学分析表明，移植的DPSC构建体在与牙本质接触的部位分化为成牙本质细胞样矿化细胞，并且能够在不需要支架或生长因子的情况下形成富含血管的牙髓样组织。这项技术的建立和发展能够制备可变大小和形状的DPSC结构，表明DPSC构建体的移植有望在无牙髓牙齿中再生牙髓组织。

1.3DPSC成脂分化 脂肪细胞由MSC定向分化而来，脂肪生成的改变参与了多种复杂疾病(如骨质疏松症、肥胖、糖尿病)和其他脂肪代谢紊乱等的发生，脂肪干细胞治疗为人类组织器官缺损、年轻化等治疗提供了新思路。

研究证实了DPSC成脂分化的能力[9]。向含有胎牛血清的培养基中加入异丁基甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素、庆大霉素等均可诱导DPSC的成脂分化[26]。从第三磨牙中提取的DPSC在完全间充质成脂培养基中培养可以获得脂肪细胞，这些细胞Oil-Red-O阳性染色，表达早期和晚期脂肪细胞特异性基因，反转录聚合酶链反应验证得到过氧化物酶体增殖物激活受体A2和转录因子AP2的表达，进一步证明了DPSC的成脂活性[27]。Lei等[28]的研究进一步描述了DPSC在体内移植后的特性，从DPSC异位移植的体内生成的牙髓样细胞中再次分离可重新获得DPSC(re-DPSC)，re-DPSC依然表达间充质标志物和MSC标志物等，如基质细胞抗原1、CD29、CD90、CD105和CD146等，此类细胞依然具有分化为脂肪细胞和软骨细胞的潜能，并具有沉积矿物质能力。具备良好脂肪生成潜能的DPSC成为诱导脂肪干细胞的另一供体组织，为DPSC来源的脂肪干细胞再生治疗研究奠定了基础。

1.4DPSC软骨向分化 关节软骨是一种具有一定厚度、高度组织化的结缔组织，位于活动关节的末端，在关节的运动和关节稳定中均起着重要作用。关节区域的急慢性损伤、软骨退化、骨关节炎等均可造成关节软骨的不可逆性损伤。关节软骨中无血管、神经的分布，软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞，代谢活性较低，当关节软骨发生损伤时，进行自我修复的可能性非常小。

Wei等[29]在2007年首次描述了DPSC软骨分化的过程，将DPSC培养在添加胎牛血清、转化生长因子-β1、地塞米松、胰岛素、抗坏血酸2-磷酸酯和丙酮酸钠的α-MEM(alpha-minimum essential medium)培养基中孵育3周，可以得到成功获得软骨向分化的DPSC。在人肋软骨细胞中加入DPSC可以有效修复关节缺损，软骨细胞能够提供软骨诱导性，促进DPSC向软骨分化，增强软骨的形成[30]。使用紫外线辅助的光刻技术制造的聚乙二醇二甲基丙烯酸、甲基丙烯酸明胶和羟基磷灰石组成的复合聚乙二醇-甲基丙烯酸明胶-羟基磷灰石水凝胶可以作为DPSC纳米结构支架，该支架结构能够支撑DPSC形成三维球体，为体外诱导软骨分化形成提供了合适的环境[31]。

体内实验也验证了DPSC在动物模型中的软骨形成能力[32-33]。Tsutsui[26]将来自乳牙的DPSC通过流式细胞仪进行表征筛选后培养扩增，与Ⅰ/Ⅲ型胶原生物材料支架复合的DPSC可以对巴西小型猪髁突直径6 mm的全厚度软骨缺损模型进行修复，术后6周透射电子显微镜检查显示，在髁突表面形成了完整的软骨膜和散在的微绒毛状结构。DPSC与支架材料的复合在修复软骨形态缺损上具有显著优势，组织学上DPSC支架可以形成丰富的细胞层次，成纤维组织的形成数量也有所增加。Mata 等[33]研究表明，在软骨形成培养基中培养DPSC和原代分离的兔软骨细胞，可以检测到胶原蛋白Ⅱ和聚集蛋白聚糖的表达。将两种细胞分别与3%藻酸盐水凝胶复合后，植入软骨损伤的兔模型中，术后3个月可以观察到两组均存在软骨再生，DPSC组软骨再生强于原代软骨细胞组。

尽管这些结果是初步的，但它们表明DPSC可能成为潜在的新型关节软骨再生的组织工程原材料，有望作为组织再生中基于干细胞疗法来修复关节缺损的适用组织工程细胞。

1.5DPSC神经分化 神经元变性、功能丧失是帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓损伤、周围神经损伤和脑卒中等的共同特征，延迟神经元变性进程是治疗此类疾病的有效途径。在过去10年的发展中，干细胞疗法成为此类疾病的潜在疗法。神经干细胞具有自我更新和分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等的能力，是干细胞疗法的理想来源。成年人的神经干细胞位于两个主要位置[34]：海马回亚区和侧脑室的脑室下区，然而该区域的神经干细胞难以通过手术大量获得。

DPSC起源于神经嵴细胞，表达多种神经嵴细胞发育相关基因及神经干细胞标志物巢蛋白等，巢蛋白阳性的DPSC具有分化为神经元细胞的潜力。此外，DPSC表达少量成熟中枢神经系统的表面标志物，包括神经元标记微管相关蛋白2、神经丝、βⅢ-微管蛋白、少突胶质细胞相关2′,3′环核苷酸-3磷酸二酯酶和星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白等[35]。

近年来，多项体外研究证明了DPSC的神经元分化能力[35-36]。DPSC可在体外表达神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经胶质细胞源性神经营养因子信使RNA，进而促进多巴胺能神经元的活性和表型特征，并保护多巴胺能神经元免受体外神经毒素6-羟基多巴胺的侵害。在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和表皮生长因子的诱导下，DPSC可以神经球样细胞的形式生长，分化的DPSC显示出神经元样的形态，表达胶质纤维酸性蛋白、神经丝和βⅢ-微管蛋白。bFGF是DPSC神经源性分化的重要生长因子，在存在bFGF的情况下，DPSC的神经球大小增加，神经源性标志物表达上调，然而，FGF受体抑制剂能够消除bFGF诱导的DPSC神经元分化。bFGF可能参与调控DPSC神经向分化的发生机制。DPSC的神经源性分化能力受Wnt信号相关蛋白表达调控，激活Wnt信号通路可以有效促进DPSC的神经源性分化并诱导表达更高水平的神经源性标志物，Wnt/β联蛋白信号转导在DPSC的神经分化中起重要作用[37]。在不含胎牛血清的1 μmol/L巯基乙醇标准培养基中培养24 h，能够诱导DPSC分化为施万细胞，这些细胞在冻存之后依然保持其神经方向分化的生物学性能，这种潜力提示DPSC有望用于组织工程和干细胞的治疗[38]。

2 DPSC再生医学前景

DPSC在再生医学领域有巨大的应用潜力，并已用于胰腺、心脏和角膜研究。将DPSC分化为类似于胰岛细胞的胰岛细胞聚集体，DPSC衍生的胰岛细胞聚集体二硫酮染色阳性，表达C肽、胰十二指肠盒因子1、配对盒转录因子4、配对盒转录因子6、神经源素3和胰岛素增强结合蛋白1，并且能够在葡萄糖诱导下释放胰岛素[38]。这些初步结果表明，DPSC可能成为糖尿病的潜在治疗方式之一。Gandia等[39]发现DPSC能够分泌促血管生成因子和抗凋亡因子，能够有效修复裸鼠诱发的心肌梗死。心肌干细胞注射后4周，DPSC便可以实现体外扩增、改善心脏功能，DPSC可能作为急性心肌梗死心脏修复的新型替代细胞疗法。DPSC与角膜缘干细胞具有相似的特征，在角膜缘干细胞缺乏症的动物模型中移植组织工程化的DPSC可以成功重建角膜上皮[40]。总之，DPSC在再生医学中发挥着关键作用。

再生牙髓新型支架的开发是再生牙科领域牙科材料研究的重要新领域，基于支架的组织工程技术为替换受损牙齿并恢复生物学功能提供了广阔的应用前景。将DPSC植入具有纳米羟基磷灰石的电纺聚ε-己内酯/明胶支架可以上调特定牙源性基因的表达，增强DPSC在体内向成牙本质细胞样表型的分化[41]。水凝胶由于其良好的生物学特性而被广泛研究为组织工程支架[42]，基于乙二醇甲壳质的可降解热响应水凝胶支架在室温下为温和的黏性溶液，但在生理条件下可迅速转变为耐用的水凝胶，可以维持DPSC的增殖和牙源性分化，有望成为牙本质再生的理想组织工程支架材料。

3 小 结

DPSC具有分化为不同细胞谱系的能力，是再生医学的宝贵资源。骨和软骨分化谱系可以为骨/软骨相关疾病的治疗领域提供有效的替代治疗方法。来源于牙髓并基于DPSC的组织工程化3D构建支架干细胞培养技术在软骨组织再生方面有巨大的潜力。DPSC的脂肪分化潜力为心脏代谢性疾病、糖尿病、肥胖相关疾病等不同研究领域的发展提供了新的契机。DPSC的神经分化有助于帮助研究许多神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病、帕金森病、脑卒中、脊柱脊髓损伤、周围神经损伤等，移植的DPSC能够通过神经营养机制保护并减少神经元损伤，干细胞移植可能成为恢复神经功能的有效治疗方法。

随着3D打印技术的进步和创新，在支架引导下的DPSC向骨骼、软骨、脂肪组织或神经组织分化，进一步分化成特定组织或器官，为多种疾病创造出新的替代治疗方案，可能在未来的再生医学中产生无限的应用前景，DPSC的研究使组织工程和再生医学领域均向前迈进了一步。