益生菌对断奶仔猪肠道屏障功能影响的Meta分析

高靖春 曹舒婷 蒋宗勇 王 丽*

(1.广东省农业科学院动物科学研究所，农业部华南动物营养与饲料重点实验室，畜禽育种国家重点实验室，岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，广东省畜禽育种与营养重点实验室，广州510640；2.仲恺农业工程学院，广州510225)

在养殖生产中多采取早期断奶的手段来适应集约化养殖，但该阶段仔猪存在肠道免疫系统尚未发育完全、肠道菌群不稳定等因素，使断奶仔猪易受到外界物理、生物等因素影响而引起腹泻、生产性能下降，导致肠道屏障功能破坏、肠道通透性增加[1-3]。自我国农业农村部宣布禁抗后，探寻绿色安全、经济实惠又便于使用的抗生素替代物来缓解仔猪断奶腹泻成为了当前研究的重要方向[4-5]。益生菌制剂是公认的比较有效的抗生素替代物之一，是一类摄入足够量时对宿主有益的活性微生物[6]。它可以黏附定植在肠道中构成微生物屏障，并逐渐形成稳定的肠道微生物群落。益生菌群定植可以竞争性地抑制有害菌，维持肠道微生态平衡，而且益生菌及其代谢产物会影响机体消化酶的产生，促进营养物质吸收，进而提高动物的生产性能，因此益生菌被普遍地应用于畜牧生产中[7-8]。多项试验表明，断奶仔猪饲粮中添加益生菌可以降低腹泻率，增加肠道有益菌群定植，提高紧密连接蛋白表达，抑制肠道炎症发生，改善肠道屏障功能最终缓解腹泻[9-11]。Meta分析是通过定量的方法对多个同类研究结果进行合并汇总，最大程度地利用前人发表的研究成果，通过适当的数学模型从统计学层面综合地解决争议和模糊性的结果，该分析可以实现增加样本含量，提高检验效能的目的，使结果更具可信度[12-13]。由于益生菌种类繁多，添加量及添加方式各不相同，因此以Meta分析的形式进行统计分析是十分必要的。本研究以Meta分析为手段，针对肠道屏障相关指标及腹泻率做出分析，探讨益生菌对断奶仔猪腹泻及肠道屏障功能的影响。

1 材料与方法

1.1 检索策略

计算机检索中国知网、维普、Science Direct、Web of Science数据库，检索年限设定为从各数据库建库至2021年4月。中文关键词包括：仔猪、断奶仔猪、益生菌，英文关键词包括：piglets、weaned piglets、probiotics，依据不同数据库情况将关键词进行自由组合检索并收集全部相关文献。

文献纳入标准：1)选择已发表的随机对照试验且研究对象为健康断奶仔猪；2)同时具备对照组及益生菌组的研究；3)设定结果指标为①腹泻率；②空肠绒毛高度、隐窝深度、绒隐比；③回肠绒毛高度、隐窝深度、绒隐比；④肠道紧密连接蛋白表达，并给出指标的平均值、标准差或标准误。

文献排除标准：1)非试验性文章(综述、会议文章)、重复发表文献；2)数据明显有误或数据不全等较低质量文献；3)无对照组文献；4)试验组非益生菌添加或与其他药物、制剂联合添加的文献。

1.2 数据提取

全文阅读后，提取以下数据材料进行后续试验：1)文献第一作者；2)试验组样本数、对照组样本数；3)断奶仔猪品种、试验期；4)给药途径、益生菌类型、添加量(如研究中出现多个添加量则先进行数据合并，后续进行敏感性分析)；5)肠道紧密连接蛋白表达量、肠道绒毛高度及隐窝深度、腹泻率。文献中如有数据不全等相关问题通过电话及邮件联系作者获取数据。

1.3 统计方法

运用R 3.6.3与R Studio 1.2.1335进行相关数据统计分析及绘图。由于不同研究中的研究时间、检测方法、表达单位等方面存在差异，选择标准化均数差(standard mean difference，SMD)作为效应指标。并结合Q检验(检验标准为α=0.1)，当P<0.1时表明研究存在异质性，反之则具有同质性。同时结合I2值(0～100%)对异质性大小进行定量分析，I2值越大则表明研究间的异质性越大。当I2值大于推荐标准40%时应采用随机效应模型(randomized effect model)进行Meta分析。在95%置信区间(95% CI)的设定上，将0值作为无效值，当分析结果的95% CI跨越无效值时，则表示无法对该项研究做出定性结论结果分析。

1.4 文献检索与筛选

依据检索式，检索的文献总计2 058篇，依据文献标题及摘要排除研究对象非断奶仔猪、综述、非益生菌单独干预文章总计1 778篇，依据试验方法及文献内容排除无结局指标、与纳入标准不符、非随机对照试验、无对照组文献总计273篇，最终纳入样本文献7篇。文献筛选流程图如图1所示。

1.5 纳入文献基本特征

本次Meta分析纳入样本的研究对象均为断奶仔猪，总计样本量为720头。试验组为单一或混合益生菌添加，添加方式分别为饲粮添加及悬液灌服，对照组饲喂无添加基础饲粮或灌服等量无菌水。基本特征信息详见表1。

2 结果与分析

2.1 益生菌添加对断奶仔猪腹泻率影响的森林图、敏感性分析及漏斗图

在纳入的文献中，共有5篇报道，10项研究(共有研究对象432头)报道了断奶仔猪添加益生菌与腹泻率的关系。根据程序指令及显示的结果，其Q值为509.4，I2=98%，自由度(df)=9，P<0.01，其异质性较大，因此应选择随机效应模型对效应值进行Meta分析，结果显示，SMD=-15.15，95% CI为-21.55～-8.76，提示了腹泻率与纳入益生菌间具有相关性。其结果的森林图如2-a所示。将各项研究一次性排除掉后应用Meta包中的Metainf命令做敏感性分析，排除各研究结果后的SMD及其95% CI汇总结果如图2-b所示。根据程序结果显示，纳入的研究可能是异质性的来源之一。若排除掉Li等[16]的异质性较大的研究结果，余下研究合并在一起时其SMD值变为-11.904，95% CI为-17.93～5.88，此时仍表明腹泻率与纳入益生菌间具有相关性，表明本项结局指标结果较稳健。因此，根据最终结果，试验组腹泻率低于对照组，结果显示其SMD=-15.15，95% CI为-21.55～8.76。采用Egger线性回归法及漏斗图法检验发表偏倚，并采用trim and filled模型进行校正。本研究中，在应用漏斗图评价法时，所纳入文献的数量标准为≥8篇，其漏斗图如图2-c所示。从此漏斗图可以看出，对此腹泻率的Meta分析存在发表偏倚的可能性，采用Egger线性回归法后，其P<0.05(t=-9.89,df=8,P<0.000 01)，验证了存在发表偏倚。故采用剪补法评价其所带来的影响，并作出校正后的漏斗图，如图2-d所示即调整发表偏倚后其SMD=-2.635 0，95% CI为-8.19～2.92(z=-0.93,P=0.352)。

2.2 益生菌添加对断奶仔猪肠道紧密连接蛋白表达量影响的森林图、敏感性分析及漏斗图

在纳入的文献中，共有3篇报道，6项研究(共有研究对象608头)报道了闭合蛋白(Occludin)的表达量与添加益生菌的关系。根据程序指令及显示的结果，其Q值为370.47，I2=99%，df=5，P<0.01，其异质性较大，因此应选择随机效应模型对效应值进行Meta分析，结果显示，SMD=2.59，95% CI为0.68～4.50，提示了Occludin的表达量与纳入益生菌间具有相关性。其结果的森林图如图3-a所示。将各项研究一次性排除掉后做敏感性分析，排除各研究结果后的SMD及其95% CI汇总结果如图3-b所示。根据程序结果显示，纳入的研究可能是异质性的来源之一。若排除掉Deng等[15]的异质性较大的研究结果，其余各项研究合并在一起时其SMD值变为1.884，95% CI为-0.12～3.89。因此，根据最终结果，Occludin表达量与纳入益生菌间具有相关性，其SMD=2.587，95% CI为0.67～4.50。采用Egger线性回归法及漏斗图法检验发表偏倚，漏斗图如图3-c所示，其P=0.223 6，大于0.05(t=1.44,df=4)，表示不存在发表偏倚。

在纳入的文献中，共有3篇报道，6项研究(共有研究对象608头)报道了闭锁小带蛋白-1(ZO-1)表达量与添加益生菌的关系。根据程序指令及显示的结果，其Q值为572.9，I2=99%，df=5，P<0.01，其异质性较大，因此应选择随机效应模型对效应值进行Meta分析，结果显示，SMD=20.83，95% CI为8.84～32.83，提示了ZO-1表达量与纳入益生菌间具有相关性。其结果的森林图如图4-a所示。将各项研究一次性排除掉后做敏感性分析，排除各研究结果后的SMD及其95% CI汇总结果如图4-b所示。根据程序结果显示，合并后的P<0.01，表明纳入的研究并非是异质性的来源之一。因此，根据最终结果，ZO-1表达量指标与纳入益生菌间具有相关性，其SMD=20.834，95% CI为8.84～32.83。采用Egger线性回归法及漏斗图法检验发表偏倚，漏斗图如图4-c所示，0.223 6

2.3 益生菌添加对断奶仔猪肠道绒毛高度、隐窝深度及绒隐比影响的森林图、敏感性分析及漏斗图

在纳入的文献中，共有4篇报道，4项研究(共有研究对象200头)报道了空肠肠道绒毛高度与添加益生菌的关系。根据程序指令及显示的结果，其Q值为94.79，I2=97%，df=3，P<0.01，其异质性较大，因此应选择随机效应模型对效应值进行Meta分析，结果显示，SMD=15.22，95% CI为5.91～24.54，提示了空肠绒毛高度与纳入益生菌间具有相关性。其结果的森林图如5-a所示。将各项研究一次性排除掉后做敏感性分析，排除各研究结果后的SMD及其95% CI汇总结果如图5-b所示。根据程序结果显示，合并后的P<0.01，表明纳入的研究并非是异质性的来源之一。因此，根据最终结果，空肠绒毛高度与添加益生菌间具有相关性，其SMD=15.22，95% CI为5.91～24.54。采用Egger线性回归法及漏斗图法检验发表偏倚，漏斗图如图5-c所示，0.050 0

在纳入的文献中，共有4项研究(共有研究对象200头)报道了空肠隐窝深度与添加益生菌的关系。根据程序指令及显示的结果，其Q值为346.82，I2=99%，自由度df=3，P<0.01,其异质性较大，因此应选择随机效应模型对效应值进行Meta分析，结果显示，SMD=-12.59，95% CI为-29.00～3.82，提示了空肠隐窝深度与纳入益生菌间不具有相关性。其结果的森林图如图6-a所示。共有3项研究(共有研究对象180头)报道了空肠绒隐比与添加益生菌的关系。根据程序指令及显示的结果，其Q值为299.55，I2=99%，df=2，P<0.01,其异质性较大，因此应选择随机效应模型对效应值进行Meta分析，结果显示SMD=26.62，95% CI为-5.06～58.31，提示了空肠绒隐比与纳入益生菌间不具有相关性。其结果森林图如图6-b所示。共有3项研究(共有研究对象180头)报道了回肠绒毛高度与添加益生菌的关系。根据程序指令及显示的结果，其Q值为332.78，I2=99%，df=2，P<0.01,其异质性较大，因此应选择随机效应模型对效应值进行Meta分析，结果显示SMD=10.59，95% CI为-25.50～46.68，提示回肠绒毛高度与纳入益生菌间不具有相关性。其结果的森林图如图6-c所示。共有3项研究(共有研究对象180头)报道了回肠隐窝深度与添加益生菌的关系。根据程序指令及显示的结果，其Q值为318.01，I2=99%，df=2，P<0.01,其异质性较大，因此应选择随机效应模型对效应值进行Meta分析，结果显示SMD=-5.80，95% CI为-25.30～13.70，提示回肠隐窝深度与纳入益生菌间不具有相关性，这可能意味着益生菌不是隐窝深度改善的影响因素。其结果的森林图如图6-d所示；共有3项研究(共有研究对象180头)报道了回肠隐窝深度与添加益生菌的关系。根据程序指令及显示的结果，其Q值为252.65，I2=99%，df=2，P<0.01,其异质性较大，因此应选择随机效应模型对效应值进行Meta分析，结果显示SMD=-5.80，95% CI为-25.30～13.70，提示了回肠绒隐比与纳入益生菌间不具有统计学相关性。其结果的森林图如图6-e所示。

3 讨 论

断奶仔猪腹泻在生猪养殖过程中常有发生，引起断奶仔猪腹泻的原因有很多，可分为感染型(如病毒、细菌等病原体侵害引起的腹泻)和非感染型(如环境、饲粮等突然改变导致的腹泻)[21]，一直以来抗生素都作为缓解断奶仔猪腹泻的主要手段，抗生素滥用导致的药物残留、耐药菌等问题严重影响畜牧业的健康发展，甚至威胁到食品安全和人类健康。国家自2020年起全面禁止畜牧行业饲用抗生素，这对仔猪健康养殖也提出了全新的挑战。因此采用绿色安全、经济实惠又便于使用的营养手段来缓解断奶仔猪腹泻成为了重要的研究方向。益生菌制剂是公认的比较有效的抗生素替代物之一，是一类摄入足够量时对宿主有益的活性微生物[22]。多项研究表明，添加益生菌能够有效缓解断奶仔猪腹泻、提高断奶仔猪生长性能，还可以改善由病原菌引发的肠道屏障功能破坏及炎症反应，提高其紧密连接蛋白表达，缓解肠道通透性提高[23-25]。

小肠是机体主要的营养物质吸收场所之一，肠道绒毛在肠腔内处于不断更新的状态，肠道隐窝细胞的不断分化促进着肠绒毛的更新，维持消化吸收功能的稳态。肠道绒毛高度增高能够增加肠道与营养物质间的接触面积，促进营养物质吸收[26]。肠道上皮细胞由多种具备不同功能的细胞组成，共同构成了肠道物理屏障，其中紧密连接蛋白是调节这一屏障功能的重要组成部分，紧密连接蛋白表达量是衡量肠道屏障通透性的重要指标[27]。紧密连接蛋白表达量下降会引起肠道通透性增加，试验证明部分益生菌产物可促进肠道上皮细胞合成紧密连接蛋白来减轻肠道炎症、维护肠道屏障功能[28]，这与本研究结果相符合。肠道菌群构成了肠道微生物屏障，稳定的肠道微生物屏障有利于营养物质的消化吸收及肠道内环境稳态的维持。试验表明添加益生菌可以有效提高断奶仔猪肠道中有益菌丰度，抑制病原菌的定植，缓解病原微生物刺激下的肠道损伤，维护肠道健康[29-30]。除此之外益生菌还能够通过维持肠道内偏酸性的pH环境、刺激消化酶及免疫活性物质的产生来影响消化吸收及肠道健康。这些都提示益生菌能保护肠道健康[31]，这与本研究中益生菌缓解了断奶仔猪腹泻的结果相吻合。

本研究表明，添加益生菌可以有效降低断奶仔猪腹泻率，提高空肠段紧密连接蛋白表达及空肠绒毛高度，但益生菌对空肠及回肠隐窝深度及绒隐比的影响并无统计学意义，该结论可为解决断奶仔猪生产过程中的肠道健康问题提供参考依据。但本研究也存在一定的局限性：1)纳入研究样本量较少；2)样本间异质性较大；3)各项研究之间的种系、饲粮配方、试验周期、益生菌添加量及菌株种类等差异较大；4)缺少质量评估标准，无法对试验结果的科学性进行客观验证。这些都可能对结果产生影响，本研究也需要进一步开展大样本、设计合理且周期足够长的随机对照试验，进一步验证研究结果。

4 结 论

本研究结果显示，饲粮中添加益生菌总体上可以有效缓解断奶仔猪腹泻，显著提高肠道紧密连接蛋白表达及空肠绒毛高度，这表明添加益生菌可以改善仔猪肠道健康、保护肠屏障功能。该Meta分析对国内外相关文章的结果进行合并，从统计层面为益生菌对断奶仔猪腹泻及肠道屏障功能的影响给予一定的数据参考。