木犀草素对氧化应激和炎症的调控机制

韩宁馨 孙雅丽 盛 帅 张 雯

(东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨150040)

木犀草素(luteolin，LUT)是黄酮亚纲黄酮类化合物，通过苯丙烷途径在植物内合成，广泛分布于蔬菜、水果、花卉、香料和药用植物中，是植物应对紫外辐射、病虫害、真菌及细菌感染的重要反应物。目前研究证实，LUT能有效调节糖脂代谢，预防心血管疾病，具有抗炎抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用[1]。近年来，畜牧行业对LUT进行了初步研究，作为天然植物成分，LUT在改善动物健康和提升动物产品品质等方面有着巨大潜力。本文就LUT的吸收代谢、抗炎抗氧化机制进行综述，并总结了LUT在畜牧生产中的研究现状，为LUT的开发利用和后续研究提供参考。

1 LUT的吸收代谢

LUT(相对分子质量286.24，分子式C15H10O6，CAS编号491-70-3)一般为黄色针状晶体，热稳定性强，不溶于冷水、微溶于热水，易溶于有机溶剂和碱性溶液，水溶液呈弱酸性。其结构特征为1个含氧吡喃环与2个苯环相连，且C5、C7、C3和C4位各有1个羟基[2]。

LUT常以其苷元(没有任何糖结合的分子)和糖苷(与一种或多种糖基结合的苷元)形式存在，苷元经口服给药后在胃肠道发生水解，经过氧化、甲基化、磺酸化以及葡萄糖醛基化等过程代谢为葡萄糖醛酸和硫酸盐结合物并进入血液循环。而糖苷(如木犀草素-7-O-葡萄糖苷)则要先经过脱葡萄糖基成为苷元后再经历上述过程[3]，且LUT对木犀草素-7-O-葡萄糖苷的生物转化率为48.78%～48.90%[4]。黄酮类化合物的结合首先发生在小肠，然后是肝脏，在那里它们被进一步代谢，产生的葡萄糖醛酸和硫酸盐衍生物促进它们通过尿液和胆汁排泄[5]。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(uridine diphosphate glucuronosyltransferase，UGT)介导的葡萄糖醛酸结合反应是机体内重要的Ⅱ相代谢途径[6]，UGT1A1、UGT1A6、UGT1A8、UGT1A9和UGT1A10是参与代谢的主要UGT亚型酶[7]。且UGT1A9是代谢LUT最重要的UGT亚型酶，介导LUT上C7—OH和C3′—OH进行葡萄糖醛酸结合反应；UGT1A6只介导LUT上C7—OH的葡萄糖醛酸结合反应[8]。Chen等[9]研究了大鼠灌胃菊花提取物(200 mg/kg)后发现尿液(6.6%)和粪便(31.3%)中LUT含量较低，侧面证明LUT及葡醛酸和硫酸酯结合物在经过结肠时会立刻被肠道菌群水解成苷元。而未被肠道吸收的LUT将到达结肠，并受到结肠微生物区系的结构修饰。另外，LUT的代谢还与“肠肝循环”有关，在肝脏中代谢的一部分LUT会与胆汁一起经总胆管排进十二指肠，共轭化分解为苷元后被小肠重吸收，由门静脉回流入肝脏，产生“双峰”现象。Li等[10]采用高效液相色谱(high-performance liquid chromatography，HPLC)法测定Beagle犬服用菊花提取物后血液中LUT含量，发现LUT的末端消除半衰期较长，且在服用LUT后6～10 h期间出现第2个吸收峰，大大增加血液中LUT含量。通过HPLC法和电化学检测(ECD)系统对大鼠血浆中游离LUT进行定量分析，Yasuda等[11]发现灌胃菊花提取物(1.7 g/kg BW)0.5 h后大鼠血浆中LUT含量迅速升高，并在1 h达到峰值(0.76～1.03 μmol/L)。另一项在小鼠上的研究表明，LUT的口服生物利用度为26%～32%，高于木犀草素-7-O-葡萄糖苷(10%～12%)，证实LUT经口服后可被有效吸收[4]。

2 LUT的抗氧化作用

2.1 清除自由基

活性氧(ROS)通常是小的、寿命短的以及高活性的分子，由氧的不完全单电子还原形成。低水平ROS可以作为触发细胞生存机制的信号，然而，当ROS水平过高超过抗氧化防御系统所抑制的范围时则会打破机体氧化还原平衡，造成氧化应激。LUT清除自由基的能力与其分子结构有关，其酚羟基与含氧自由基发生抽氢反应，生成半醌式自由基，终止自由基链式反应。其中B环上C4′—OH、C5′—OH邻二羟基的构成对其抗氧化能力的增强有着关键作用[12]。杨怡萌等[13]对LUT与1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基甲醛溶剂发生抽氢反应的反应焓变进行分析，发现C4′—OH(74.47 kJ/mol)和C5′—OH(90.79 kJ/mol)的反应焓值远小于其他酚羟基位点。同时C4′和C3′上的邻位羟基还可与C4上的羰基氧形成分子内氢键，加强半醌式自由基稳定性，进一步提高LUT对自由基的清除能力[14]。除此之外，作为LUT发挥抗氧化活性的关键位点，B环上C4′—OH、C5′—OH邻二羟基还可螯合金属离子形成配合物。体外研究发现，木犀草素-Zn配合物抗DPPH自由基的活性还要强于LUT本身[15]，再次印证了LUT针对含氧自由基的结构优势。

2.2 增强抗氧化酶活性

多种抗氧化酶是机体维持氧化还原平衡的主要物质，是有氧代谢过程中重要的保护防线，LUT可通过提高体内抗氧化酶水平和还原性物质的生成来应对组织和细胞的氧化损伤。研究发现，对黄曲霉素B1诱发肝脏损伤的小鼠连续15 d灌胃LUT(50 mg/kg)后，肝脏组织中过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性大大提高，肝脏组织中谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性等指标呈下降趋势[16]。此外，在赫曲霉素A诱导的大鼠肾细胞损伤试验中添加LUT后，细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放量下降，ROS积累减少，线粒体膜电位升高，细胞活力恢复至正常水平[17]。除此之外，多项研究证实，LUT的抗氧化机制还与核因子E2相关性因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)/Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap-1)通路有关，Nrf2是一种对氧化还原敏感的转录因子，广泛存在于身体各个器官，在抗氧化反应中起着关键作用。正常生理条件下，Nrf2被Keap-1隔离在细胞质中，处于非活性状态，使其不断泛素化和被蛋白酶体降解。当Nrf2暴露在氧化应激下时，LUT作用于此通路，使得Nrf2立即从Keap-1的抑制状态下释放并移位至细胞核，并与Maf蛋白结合形成异源二聚体再与抗氧化反应原件(antioxidant response element，ARE)结合，激活血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、NADPH醌氧化还原酶(NADPH quinone oxidoreductase 1，NQO1)等下游抗氧化蛋白和Ⅱ相代谢酶转录，在机体适应性反应和细胞保护中扮演重要角色[18]。Li等[19]认为LUT可通过Nrf2/Keap-1通路缓解小鼠结肠炎症状，不仅如此，LUT对重金属中毒[20]、缺血再灌注损伤[21]等模型均有明显治疗作用，其作用机制均与下调ROS水平、调控Nrf2/Keap-1通路有关。因此LUT可从多条途径发挥抗氧化功能，保护机体免受氧化损伤。

3 LUT的抗炎作用

3.1 调控促炎介质

炎症是机体针对创伤、应激和病原体等多种因素的生理反应过程，是免疫监视、组织损伤后再生所必须的。正常状态下机体自身可以调节炎症反应，然而炎症因子的持续刺激会招募更多炎症相关细胞从血液迁移至炎症组织[22]。LUT的抗炎作用一部分是通过降低多种促炎细胞因子、趋化因子的表达发挥作用，其中包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-31、IL-33以及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等[23]。此外，LUT还可提高IL-10、IL-13等抗炎因子表达，Xie等[24]研究发现LUT有效上调盲肠结扎穿刺诱导的肺脏损伤小鼠血清和肺泡灌洗液中IL-10水平。不仅如此，LUT还有改变巨噬细胞M1/M2极化比例，平衡各类炎症因子的潜力，Wang等[25]经过LUT干预后发现M1型表面标志物CD86、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-1β和IL-6的表达明显降低，而M2型标志物CD206、IL-10和IL-13的表达明显增加。此外，LUT还能调控多种内皮细胞黏附因子，通过抑制单核细胞对血管内皮细胞的激活、黏附和迁移，避免产生泡沫细胞和斑块，预防血管炎症和相关并发症出现。Jia等[26]通过在饲粮中添加LUT(0.6%)对TNF-α刺激后的小鼠进行3周的膳食补充后发现，小鼠血液中MCP-1、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的循环水平显著降低，主动脉内膜层、内皮层附近弹性蛋白纤维等精细组织得到保留，血管壁完整性大大提高。Su等[27]在研究肠系膜小静脉炎症时发现，对大鼠进行LUT灌胃治疗后，白细胞与静脉内皮细胞间的黏附得到有效抑制，血管通透性和肠微循环血量均有显著改善，充分说明LUT可有效控制体内各类促炎介质并与体内抗炎因子形成正向动态平衡，构建正向稳定的机体内环境。

3.2 调节促炎基因表达

LUT的抗炎活性还与促炎基因的控制有关，其中核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是促炎基因表达调节因子之一，介导多种炎症因子生成，正常状态下，NF-κB与其抑制蛋白(IκB)互相结合并以失活状态存在于细胞质，一旦受到刺激，位于细胞膜上的Toll样受体4(TLR4)通过髓系分化因子88(MyD88)激活IκB激酶(IKK)，IκB被IKK磷酸化降解，使得NF-κB释放并从细胞质转移至细胞核，诱导多种靶基因转录[28]。研究证实，LUT以剂量依赖的方式阻断NF-κB/p65易位和NF-κB/p65在细胞核内的磷酸化水平。在棕榈酸刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVCEs)中，LUT的预处理可以抑制IκB激酶β亚基磷酸化，下调TNF-α、IL-6的mRNA水平[29]。同时，LUT还可控制NF-κB上游信号，通过抑制MyD88蛋白表达减少巨噬细胞活化脂肽-2(MALP-2，Toll样受体2激动剂)和CpG1668(Toll样受体9激动剂)生成，从而抑制NF-κB的激活[30]。此外，LUT还对乙酰化酶(HAT)的活性有抑制作用，Kim等[31]发现LUT可通过干扰P300与TNF-α启动子区间的结合，减少HAT与NF-κB和TNF-α乙酰化的相互作用，从而抑制NF-κB下游促炎因子转录。

3.3 调节炎症小体

另一个与NF-κB通路相关的研究与NOD样受体家族蛋白3(NOD-like receptor family protein 3，NLRP3)炎症小体有关。NLRP3炎症小体是一种存在于胞浆的蛋白质复合物，在受到刺激信号后，NLRP3炎症小体首先进入“启动阶段”，TLR4信号通路被激活，NF-κB向核内转位，启动NLRP3、IL-18前体(pro-IL-18)和IL-1β前体(pro-IL-1β)大量转录。接着进入“激活阶段”，NLRP3通过凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)招募半胱天冬酶-1(Caspase-1)完成炎症小体的组装[32]。目前LUT在牙周炎[33]、类风湿性关节炎[34]等多种动物模型中均被证实有抑制NLRP3炎症小体合成的作用。除了通过控制NF-κB通路减少炎症小体生成之外，LUT还可直接阻断ASC寡聚，下调炎症小体相关蛋白表达。Lee等[35]研究发现，LUT处理小鼠巨噬细胞30 min后，对NLRP3炎症小体介导的IL-1β分泌有50%～60%的抑制作用，同时抑制Caspase-1活化，达到双重抑制IL-1β、IL-18的作用。

4 LUT在动物生产方面的应用

自2006年欧盟全面禁止抗生素饲料以来，植物性饲料添加剂得到广泛关注。LUT的抗氧化能力在畜禽生产应用中有着重要意义。奶牛在围产期会产生严重的氧化应激，黄酮类化合物作为饲料添加剂被证实可以限制瘤胃酸中毒发生率，提高围产期新陈代谢能力[36]。蛋鸡经过一段时间高产，体内蓄积的自由基所产生的氧化反应损伤会影响蛋鸡生殖功能。杨慧等[37]研究发现，与对照组相比，在蛋鸡产蛋后期的饲粮中添加富含LUT(10%)的花生壳提取物能显著提高血清中的超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-Px活性，降低产蛋鸡后期血清中的丙二醛含量，改善蛋鸡后期的产蛋率和采食量，提高蛋鸡生产性能。此外，LUT还能改善猪卵母细胞成熟、发育及受精能力。Park等[38]研究发现，体外补充LUT(5 μmol/L)可显著恢复过氧化氢(H2O2)暴露引起的细胞器缺陷和氧化应激损伤，并提高体外受精胚胎的卵裂率和囊胚形成率，改善猪胚胎体外发育能力。另有研究表明，LUT还可提高冷冻公猪精子质量，补充LUT(80 μg/mL)后，公猪精子活力达55.70%，质膜完整率达45.53%，顶体完整率为44.58%，显著高于对照组[39]。这说明LUT对猪卵母细胞和公猪精子发育均有积极影响。

此外，LUT还可作为植物防腐剂对肉类进行保鲜，Mhalla等[40]将LUT作为天然植物防腐剂应用于4 ℃贮藏30 d的牛肉末，发现该组分对单核细胞增多性李斯特菌有显著抑制作用。郝瑞等[41]将LUT作为天然保鲜剂成分对牛背最长肌保鲜作用进行研究证实，LUT与冰温保鲜有协同作用，可将牛背最长肌的货架期延长至16 d，比单一冰温保鲜有更好的贮藏效果。

5 小 结

随着对LUT的广泛研究，越来越多的证据证明LUT在各类疾病模型中均有很好的治疗效果，同时LUT也可作为优质饲料添加剂应用于畜牧生产，有效提高动物生产性能和抗应激能力，还可作为母猪卵母细胞发育成熟和精子的保护剂。但是目前对于LUT在饲料应用中的添加机制等研究还缺少相关数据，存在一定局限性，对投入实际应用还有一定距离。因此，今后还需进一步研究LUT作为饲料添加剂的作用效果和适宜添加量，完善LUT体内外作用机制，为畜牧生产和新药研究提供更多理论依据。