动脉粥样硬化与CD36相关的氧化应激研究进展

王丹丹，封 锐，师 帅，魏娜敏，胡元会

导致动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)发生的机制十分复杂，氧化应激是重要的机制之一。 活性氧(ROS)在体内的作用与其浓度相关，中等浓度的ROS能够传递重要信号[1]，然而过量或持续的ROS产生，会导致负责清除ROS的系统超负荷，此类现象称为氧化应激(oxidative stress，OS)。目前可知的多种AS致病原因，如吸烟[2]、糖尿病[3]、高脂血症[4]、高血压[5]等，均能够增加ROS产生，损害内皮功能，降低一氧化氮(NO)生成。当过量的ROS产生，以及低密度脂蛋白(LDL)氧化物增加时，会促进AS的形成[6]。

1 AS中的氧化应激系统

在血管壁中，存在许多ROS生成系统，如还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidases，Nox)、黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)、线粒体和功能失调的内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)系统。这些氧化剂生成系统之间存在着相互作用[7]，Nox能引起eNOS系统解偶联[8]、XO活性升高[9]以及线粒体ROS生成。

1.1 Nox系统 Nox是人体内最重要的ROS生成系统之一。最初，Nox是在吞噬细胞质膜上被发现，后来研究证明其不仅在浸润的单核/巨噬细胞中表达，而且血管壁中也有表达，随后，作为Nox2(gp91phox)的同源物Nox1、Nox3、Nox4、Nox5也被发现，统称为Nox家族，是具有多亚基单位的酶复合物，在ROS形成过程中有重要作用。

Nox的各种亚型在AS中的作用已经被研究过[10]。有研究显示，在小鼠中，Nox1和Nox4由血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)表达[11]，Nox2和Nox4由内皮细胞表达[12]。Nox1在ApoE-/-小鼠中的缺失可缓解AS发生，Nox2缺失也被证明与小鼠降主动脉AS的减少有关。但是，Nox4在AS形成中的作用是有争议的，有不同证据证明其对AS有保护和促进功能。有研究发现，Nox5在小鼠基因组中缺失，但在糖尿病、高血压和人类AS病变中上调[13]。巨噬细胞的Nox活性是氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)生成的重要组成部分[14]。并且，Nox活性还被认为在内皮黏附分子的表达、单核细胞的浸润和VSMCs增殖中起作用[15]。

1.2 XO系统 XO存在于内皮和血浆中，产生超氧阴离子和过氧化氢(H2O2)。有证据显示，在实验性AS和人AS斑块中，内皮细胞XO[16]和血浆XO[17]的活性均升高，即证明了由XO生成的超氧化物能促进AS形成[18-19]。另外，血管紧张素Ⅱ和振荡剪切应力可增加内皮XO的表达[20]。研究表明，XO抑制剂可以减少ApoE-/-小鼠AS的发展[21]，减轻重度吸烟者的内皮功能障碍[22]。另外，XO能够刺激巨噬和VSMCs表达清道夫受体氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)和CD36，增加ROS生成，促进泡沫细胞形成。此外，XO产生的尿酸也可通过促进CD36表达触发泡沫细胞形成[23]。

1.3 线粒体电子传递链 线粒体酶在生理状态下产生超氧阴离子，也可因功能障碍或抗氧化机制失效导致过量ROS产生。近年来对ROS与炎症发生机制的研究发现，来自线粒体的ROS作为信号转导分子，可引起内皮功能障碍，并与eNOS解耦联，诱导炎症细胞浸润和活化，增加内皮细胞和VSMCs的凋亡[24]。此外，动脉粥样硬化性高脂血症、高血糖均可诱发线粒体功能障碍。线粒体ROS的生产过剩可导致LDL氧化增多，促进AS进展[25]，并且其功能障碍可导致细胞凋亡的发生，导致斑块稳定性降低以致破裂。Nox系统和线粒体系统在ROS生成和内皮功能障碍方面存在相互作用，这可能与AS的发生有关。

1.4 功能障碍的eNOS系统 NO可通过激活eNOS系统在内皮中持续生成。但是在与氧化应激相关的病理条件中，或者当eNOS的辅因子四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)血管组织水平较低时，可导致eNOS功能障碍，从而产生超氧化物而不是NO。研究表明，eNOS辅助因子的有效性与内皮功能障碍的发展呈负相关[26]。体外实验研究证明，eNOS中的NO构成抗AS分子，对AS有保护作用[27]，eNOS缺乏可加速eNOS缺失小鼠AS病变的过程。

2 CD36在AS氧化应激中的作用

清道夫受体是糖蛋白受体之一，于人体组织中大量表达，能促进AS形成，其主要亚型包括：SR-A、SR-B、CD68(SR-D)、LOX-1(SR-E)、SREC(SR-F)以及SR-PSOX(SR-G)[28]，其中SR-B分为SR-BI和CD36两个亚型。Kunjathoor等[29]研究证明对ox-LDL进行识别的主要清道夫受体为CD36。CD36可于不同细胞中表达，如单核与巨噬细胞、血小板、内皮和VSMCs等[30]，可与多种组织蛋白结合。其中，单核巨噬细胞上的CD36是吞噬摄取ox-LDL的主要受体。关于CD36的调节，Nicholson[31]研究证明，ox-LDL可以通过活化过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)调节CD36的转录。另有研究发现，胞内胆固醇能使CD36表达升高[32]，转化生长因子(transforming growth factor，TGF)β1和TGF β2均通过PPARγ途径下调CD36的表达。另外，CD36亦能促进凝血和单核细胞聚集、促进炎症反应和氧化、凋亡等多种功能，是非常重要的一类糖蛋白受体。

配体介导的CD36信号的特点是促进细胞内ROS的产生，而ROS依赖于环境和细胞类型。血管、造血细胞产生ROS的机制各不相同，CD36在VSMCs、内皮、单核、巨噬细胞和血小板中均能参与氧化应激的发生。

2.1 CD36参与VSMCs氧化应激过程 VSMCs对血管的功能和血液流动至关重要，其功能障碍可在血脂异常时导致AS病变发生，增加斑块破裂的风险。当VSMCs表达CD36时，其具有调节血管功能的作用。值得注意的是，当VSMCs受到氧化脂质的刺激时，CD36信号下调了关键的抗氧化因子，如氧化还原敏感因子核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)等。有学者发现在化学诱导的动脉损伤后，CD36-/-小鼠血管壁中的ROS明显低于正常型小鼠，表明CD36可能参与了VSMCs自身ROS的生成[33]，并且证实了氧化还原敏感转录因子Nrf2介导的VSMCs中的CD36相关通路能够下调内源性的抗氧化防御。转染Nrf2或其下游靶点[如血红素加氧酶-1(HO-1)]在体内外均能抑制ROS的生成，改善AS和阻塞性血管疾病[34-35]。Nrf2的下调是通过Src家族激酶成员Fyn的磷酸化实现的，并且在CD36信号通路中的下调并不是唯一的。Nrf2的激活因子如ox-LDL和4-羟基壬烯醛(4-HNE)，可促进小鼠巨噬细胞[36]和巨噬细胞样细胞系[37]中CD36的表达。Nrf2介导CD36表达以支持疟原虫吞噬的过程也印证了上述机制[38]。

2.2 CD36参与内皮细胞氧化应激过程 CD36也表达于微血管内皮细胞(microvascular endothelial cells，MVEC)，在内皮功能中发挥作用。CD36与血小板反应蛋白(TSP)-1和TSP-2及其他几种抗血管生成蛋白结合时，是通过与血小板反应蛋白结构同源重复序列(thrombospondin structural homology repeats，TSR)区域相结合以发挥作用的[39]。CD36识别TSR区域可促进MVEC的凋亡信号，增强促血管新生的血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)的去磷酸化程度，减少内皮细胞迁移[40]。MVECs上的CD36也能识别细胞外囊泡表面的阴离子磷脂酰丝氨酸，从而抑制细胞迁移[41]。这是与Src家族激酶Fyn、Nox的激活和ROS的生成途径相关的。当CD36的遗传缺失，Src家族激酶或Nox受药理学抑制，或SOD对过量ROS进行了清除时，则囊泡介导下的内皮细胞迁移可以恢复。这些数据表明，CD36产生的ROS能够在循环细胞外囊泡大量存在的特定条件下调节MVEC的迁移。

2.3 CD36参与单核/巨噬细胞氧化应激过程 研究提示CD36具有促进巨噬细胞中ROS生成的功能[42]。阻断CD36或抑制Nox可减少ox-LDL诱导的ROS形成，证明了巨噬细胞中CD36信号可直接诱导ROS形成[43]。Kotla等[44]发现CD36基因表达在巨噬细胞系统中受到ROS的机械调控，是通过调节布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton′s tyrosine kinase，BTK)磷酸化酰基转移酶p300的途径来驱动CD36表达，随后P300能够活化信号转导和转录激活因子(STAT)1。这些信号事件随后促进STAT1和PPARγ驱动CD36的表达。这些研究将巨噬细胞系统ROS的产生与蛋白质的遗传转录联系起来。同时有研究显示，氧化脂质刺激巨噬细胞也能够上调PPARγ介导的CD36表达的转录途径[45]。

氧化甾醇能够通过部分依赖清道夫受体的机制在单核/巨噬细胞中促进AS进展。有研究表明，氧化甾醇[46]，特别是7-酮胆固醇被证明可以促进巨噬细胞中CD36基因的表达，并能够促进ox-LDL的摄取，加剧泡沫细胞的生成[47]。

2.4 CD36参与氧化应激过程调控血小板活化 有证据显示，CD36与氧化的LDL或微粒结合，能够激活血小板活化过程[48]。在不良因素(如高脂血症和氧化应激)刺激下，该通路在体内被活化。CD36基因的缺失可保护小鼠免于生成与高脂血症相关的病理性血栓，但对正常止血无明显影响。因此，以CD36或其信号通路为基础，有可能研究出可供AS病人使用的新型抗血栓疗法。在脂质代谢紊乱小鼠模型中，血小板CD36能调控血小板活化与聚集；而在人类中，血小板CD36受体表达增加与ox-LDL介导的血小板活性升高和血栓形成风险具有相关性。

2.4.1 CD36参与氧化应激相关的血小板信号传导途径 在血小板中，CD36与多种信号通路相互作用。有研究表明，CD36能够招募并激活Fyn和Lyn，Fyn是血小板中能够与ox-LDL和其他配体相结合的主要的Src家族激酶之一[49]，可促进脾酪氨酸激酶(Syk)活化[50]、ROS产生[51]，以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)激活[52]。

目前，由ROS激活的血小板通路尚未完全确定。但是血小板确实表达了一些氧化还原敏感的细胞因子，如MAPK家族成员[53]，这些因子在ROS及H2O2刺激下可以激活。在典型的MAPK家族中，血小板系统中的CD36信号转导促进c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)2[54]和细胞外信号调节激酶5(extracellular signal regulated kinase，ERK5)的激活。这两种激酶都对氧化还原信号敏感，可通过外源H2O2干预或细胞内ROS信号刺激被激活[55]。尽管血小板中ROS是否能直接激活JNK尚不清楚，但JNK对CD36激活血小板和加速动脉血栓形成是非常必要的[56]。有研究显示，用药物JNK抑制剂SP600125可阻止ox-LDL激活血小板[57]。研究显示JNK在野生型小鼠的血栓中直接激活，而在CD36缺失的动物中没有，JNK也能够通过经典的生理激活剂如蛋白酶激活受体或胶原受体糖蛋白Ⅵ等促进血小板活化[58]。ERK5是MAPK系统中的一员，近几年备受人们关注。有研究发现，血小板ERK5能够被产生ROS的生理激动剂不同程度地激活[59]。此外，细胞暴露于H2O2后，可直接激活血小板ERK5。在小鼠心肌梗死模型的ROS生成较丰富的组织缺血时，血小板ERK5激活能够促进其梗死面积进一步扩大。

另外有研究显示，血小板衍生微粒(platelet micro-vesicles，PMVs)是血栓形成的主要原因，PMVs可能是氧化应激激活血小板的重要来源，氧化应激可启动AS血栓形成的凝血过程[60]。PMVs是氧化损伤、MAPK信号和血小板活化的中枢介质，ox-LDL能够显著促进PMVs产生。PMVs与血小板CD36的结合触发丝裂原活化蛋白激酶激酶4(MKK4)/JNK信号传导并激活血小板。此外，PMVs以CD36和磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)依赖方式增强血小板氧化产物。另外，还发现PMVs与血小板的相互作用促进了人8异前列腺素F2α(8-iso prostaglandin F2α，8-iso-PG-F2α)的产生，这是氧化应激发生的一个重要指标。这一功能依赖于CD36和PS，提示CD36不仅能激活血小板，而且能增强氧化应激，因此可以认为ox-LDL刺激产生的PMVs能够促进血小板活化和氧化应激，而氧化应激的增强进一步增加了PMVs的生成。

Nox1和Nox2是血小板中产生ROS的主要复合物[61]。Violi等[62]研究表明，Nox产生的ROS能够促进血小板活化。Magwenzi等[63]研究表明，ox-LDL与血小板CD36结合能够刺激Nox2表达，从而促进血小板ROS和超氧化物的生成，并且激活Nox2的过程是与CD36信号通路相关的，强调CD36调节ROS产生能够驱动体内和离体血小板激活。

2.4.2 CD36参与氧化应激降低血小板抑制传导途径 敏感性NO-环磷酸鸟苷(3′-5′-cyclic guanosine monophosphate，cGMP)-蛋白激酶G(protein kinases G，PKG)信号通路对体内血小板功能的调控至关重要，NO激活可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylyl cyclase，sGC)产生cGMP[64]。cGMP依赖性激酶(cGMP-dependent kinase，cGK)是cGMP的主要细胞受体[65]。然后，cGK催化其底物磷酸化，从而启动各种细胞反应，如平滑肌松弛、血小板聚集延迟等[66]。有研究证明，CD36产生的ROS抑制了NO/cGMP信号介导的天然血小板抑制途径[66]，发现CD36/Nox产生的ROS能够调节PKG以阻止其底物-血管扩张刺激磷蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein，VASP)的下游激活，而VASP是血小板抑制性信号传导的中枢。ox-LDL导致血小板cGMP通路敏感性降低进而阻止下游信号传导，为氧化脂质促进血小板活化提供了新的机制。然而，当血小板与抗Src家族激酶、磷脂酶C-γ2(PLCγ2)、蛋白激酶C(PKC)和Nox的CD36阻断单克隆抗体或抑制剂共同孵育时，ox-LDL介导的脱敏可被阻止。因此，以上研究表明，CD36的氧化还原信号事件除了对促进血小板活化途径的作用外，还对血小板抑制途径产生负面影响。

3 小 结

目前研究存在的问题有：①在体内氧化应激系统里，Nox家族的Nox4在AS形成中的作用具有争议，最近的一些研究表明其对AS形成有保护作用，证明了氧化应激系统在人体中的作用多样且复杂，对其认识还不足，需要更深入的研究；②氧化应激直接导致ERK5激活的机制尚不清楚，了解其信号转导机制，对于阐明一种新的途径具有重要意义；③在平滑肌细胞中，CD36信号产生ROS的具体来源尚未确定，有药理学研究表明，ROS可能来自线粒体和非线粒体来源[67]。VSMCs的CD36信号通路中ROS来源还需要更深入的研究。

CD36作为促AS发展、促血栓形成和抗血管生成物的受体，其相关研究已经取得一定的进展，其介导的氧化还原信号是多途径的，与其他氧化途径息息相关，受各种细胞因子的调控。随着研究方式的进展，未来可以应用多种成像和分析方法对其功能进行探索。也可以从已知的氧化系统及通路入手，研究CD36与系统中各组分的关联，探索其影响氧化应激的新的机制。氧化应激过程是影响AS发生和进展的主要机制之一，而内皮产生的NO能够延缓AS形成。目前所知的多种危险因素能够降低内皮细胞NO的产生，并且促进各种氧化应激通路产生ROS，包括Nox、XO、功能障碍的eNOS和线粒体。AS发生过程中的关键分子事件，如脂蛋白和磷脂的氧化修饰、内皮细胞活化和巨噬细胞浸润、活化，都受到氧化应激的促进。因此，除了防治已确定的危险因素外，对血管氧化应激的预防和内皮功能的改善也应当被作为治疗的途径之一，为临床药物开发和应用提供新的角度和思路。