CircRNA锌指RNA结合蛋白在恶性肿瘤中作用研究进展

刘 浪，王海存，高 欣，刘广麟，赵俞乔，姜兴明

(哈尔滨医科大学附属第二医院 肝胆胰外科， 黑龙江 哈尔滨 150086)

环状RNA(circular RNA, circRNA)作为一类内源性功能非编码RNA，是由前体mRNA剪接形成的闭环结构RNA[1]。与线性RNA相比，具有封闭环状结构的circRNA具有高度的稳定性和对RNA酶的抗性，在各种动物与人类组织和细胞样本中表现出高度的特异性表达[2]。CircRNAs在多种恶性肿瘤中呈现异常表达并通过靶向调控关键基因影响肿瘤的发生发展[3]。环状RNA锌指RNA结合蛋白(circular RNA zinc finger RNA binding protein, circRNA-ZFR)在诸多人类恶性肿瘤中异常表达, 并参与调控肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移等恶性生物学行为。本文对circRNA-ZFR在恶性肿瘤中的研究进展予以总结。

1 CircRNA-ZFR概述

CircRNA-ZFR是一种新发现的环状RNA，定位于人类染色体5p13.3。作为环状RNA家族的一员，circRNA-ZFR在肝细胞癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等人类恶性肿瘤中呈异常表达，并通过调控肿瘤微环境以及细胞周期等多个方面影响肿瘤的发生发展[4]。机制上，circRNA-ZFR在诸多肿瘤中作为肿瘤抑制因子或致癌基因发挥作用，其作用机制包括充当分子海绵竞争性吸附miRNA进而调控靶基因的表达，以及通过特定的RNA结合域与靶RNA结合蛋白相互作用来形成RNA-蛋白复合物，从而影响人类恶性肿瘤的进程。

2 CircRNA-ZFR与肿瘤

2.1 CircRNA-ZFR与乳腺癌

CircRNA-ZFR在乳腺癌肿瘤组织和肿瘤细胞内呈异常高表达，并且circRNA-ZFR的表达水平与癌肿远处转移及临床分期密切相关；生存曲线分析表明circRNA-ZFR表达水平越高，患者的术后生存时间越短。外源性沉默肿瘤细胞内circRNA-ZFR的表达后能够显著下调肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡，同时肿瘤细胞的迁移和侵袭能力也受到明显抑制。CircRNA-ZFR与miR-578以及miR-578与HIF1A(hypoxia-inducible factor 1α)存在相同的结合位点；circRNA-ZFR能够直接靶向作用于miR-578，进而阻断miR-578与下游促癌因子HIF1A 3′-UTR的结合，通过上调HIF1A的表达来促进肿瘤细胞的增殖与侵袭迁移并抑制细胞凋亡；并且预先外源性上调miR-578的表达可部分抑制下调circRNA-ZFR对肿瘤细胞恶性生物学行为的促进作用。上述研究结果提示：乳腺癌中异常高表达的circRNA-ZFR通过调控miR-758/HIF1A轴来促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，并抑制凋亡发生[5]。

2.2 CircRNA-ZFR与甲状腺乳头状癌

CircRNA-ZFR在甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)内呈上调表达，在PTC肿瘤组织和细胞内circRNA-ZFR表达水平明显升高；并且临床病理学数据分析结果显示circRNA-ZFR的异常高表达与癌症临床分析呈正相关，高表达circRNA-ZFR组患者的预后相对更差。利用特异性siRNA转染从而外源性沉默肿瘤细胞SW579和TPC-1内circRNA-ZFR的表达，肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力受到明显抑制。机制研究结果表明：circRNA-ZFR可通过ceRNA(competitive endogenous RNA)机制内源性吸附miR-1261来下调其表达，导致miR-1261对下游靶基因C8orf4(transcriptional and immune response regulator)3′-UTR的负向作用减弱；并且预先外源性上调靶基因C8orf4的表达后，沉默circRNA-ZFR对肿瘤细胞SW579增殖及侵袭迁移的抑制作用部分减弱。综上，肿瘤中高表达的circRNA-ZFR通过ceRNA机制调控miR-1261来上调促癌基因C8orf4的表达，进而增强甲状腺乳头状癌的恶性生物学行为[6]。

2.3 CircRNA-ZFR与肾细胞癌

相比于癌旁正常组织，肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)肿瘤组织内circRNA-ZFR呈现明显的高水平表达；并且RCC肿瘤细胞内circRNA-ZFR同样为异常上调表达，利用siRNA转染来外源性沉默RCC肿瘤细胞ACHN与CAKI-1内circRNA-ZFR的表达后，细胞的增殖及侵袭迁移受到明显抑制。体外细胞实验及构建luciferase野生型及突变型载体的双荧光素酶报告基因实验进一步证实：circRNA-ZFR通过内源性海绵吸附机制来下调miR-206的表达，进而同趋势提升miR-206下游靶基因Met的表达水平(阻断miR-206与Met 3′-UTR间相互作用)，而上调的Met能够维持促癌基因Wnt3a和β-catenin的高水平表达；同时高表达的circRNA-ZFR可以激活PI3K/AK信号通路并上调通路相关蛋白的表达。上述实验研究结果表明：肾细胞癌中异常上调表达的circRNA-ZFR通过miR-206/Met轴来激活Wnt/β-catenin及PI3K/AKT信号通路，并影响通路相关蛋白的表达，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等行为，调控肿瘤的发生发展[7]。

2.4 CircRNA-ZFR与膀胱癌

对104例膀胱癌患者的临床病理学数据分析以及定量检测发现：circRNA-ZFR在肿瘤组织和肿瘤细胞中异常高表达；circRNA-ZFR的表达水平与肿瘤体积、临床分期和淋巴结转移显著相关，并且高表达circRNA-ZFR患者的总体生存时间更短；相关分析结果指出circRNA-ZFR还可作为膀胱癌患者早期诊断的标志物。外源性下调肿瘤细胞中circRNA-ZFR的表达后，肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显减弱，并且细胞周期被阻滞在G0/G1期。CircRNA-ZFR与miR-377和miR-377与促癌因子ZEB2(zinc finger E-box binding homeobox 2)存在相同的结合位点，双荧光素酶报告及细胞学实验证实膀胱癌中异常高表达的circRNA-ZFR可通过ceRNA机制竞争性吸附miR-377，阻断其与下游靶基因ZEB2的结合进而上调ZEB2的表达，最终发挥促癌效应[8]。

在膀胱癌的另一项研究中：circRNA-ZFR的下调对肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移具有明显的抑制作用；小鼠模型体内肿瘤的生长速率同样因circRNA-ZFR的下调呈现减慢的趋势。进一步研究表明：circRNA-ZFR可内源性竞争吸附miR-545和miR-1270，进而调控下游促癌因子WNT5A的表达(WNT5A作为WNT家族成员，可通过激活Wnt/β-catenin信号通路调控肿瘤细胞的多种恶性生物学行为[9])；外源性上调circRNA-ZFR的表达后，细胞内Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白水平及WNT5A表达水平明显升高，而miR-545/miR-1270表达水平出现降低。综上，膀胱癌中异常高表达的circRNA-ZFR可通过miR-545/miR-1270/WNT5A轴激活Wnt/β-catenin信号通路，进而实现对肿瘤的促癌作用[10]。

2.5 CircRNA-ZFR与食管鳞癌

CircRNA-ZFR在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)肿瘤组织和细胞中表达明显高于癌旁组织和正常细胞；并且circRNA-ZFR的表达水平与癌肿大小、肿瘤侵袭深度及临床分期密切相关。将过表达circRNA-ZFR的质粒转染进ECA109细胞后，肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显增强，提示circRNA-ZFR对ESCC肿瘤细胞恶性生物学行为有促进作用。机制上，circRNA-ZFR可作为ceRNA直接靶向吸附miR-377进而阻断miR-377与下游靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的结合，通过同向调控细胞中VEGF的表达进一步影响肿瘤的发生发展[11]。综上,食管鳞癌中过表达的circRNA-ZFR可通过miR-377/VEGF轴促进肿瘤的进展[12]。

2.6 CircRNA-ZFR与宫颈癌

宫颈癌作为全球女性最常见的癌，其高侵袭性和高死亡率威胁着越来越多的女性健康。宫颈癌组织和肿瘤细胞中异常高表达的circRNA-ZFR与肿瘤淋巴结转移密切相关，并且circRNA-ZFR对宫颈癌患者早期诊断有一定的预测价值。通过转染siRNA特异性下调SiHa宫颈癌肿瘤细胞中circRNA-ZFR的表达后，肿瘤的细胞增殖、侵袭和迁移能力明显减弱；此外，由于circRNA-ZFR表达的下调，处于S期的细胞比占显著下降并且大量细胞被阻滞在G0/G1期。机制上，宫颈癌中过表达的circRNA-ZFR可作为细胞支架，诱导CDK2/cyclin E1和CDK2/SSBP1蛋白复合物的形成进而激活Rb-E2F1通路，通过促进抑癌基因Rb磷酸化以及正向调节E2F1的乙酰化进一步促使细胞发生G1/S期的转变，同时加速细胞增殖，从而最终实现对宫颈癌的促癌作用[13]。

2.7 CircRNA-ZFR与肝细胞癌

在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的研究中，circRNA-ZFR在肿瘤组织和细胞中明显高表达，并且与患者不良预后密切相关。外源性下调Huh7肿瘤细胞中circRNA-ZFR的表达后，细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显下降，表明circRNA-ZFR在HCC中发挥一定的促癌作用。机制研究发现，circRNA-ZFR可海绵吸附miR-3619-5p进而阻断其与下游促癌基因CTNNB1(catenin beta 1)3′-UTR的结合，通过同向调控HCC肿瘤细胞中CTNNB1的表达来发挥促癌作用[14]。

对30例HCC患者临床样本进行的定量检测发现，circRNA-ZFR在肿瘤组织中表达更高；并且circRNA-ZFR的表达与肿瘤临床分期和癌肿大小密切相关，但与年龄性别无关。在体外利用siRNA特异性下调HepG2细胞中circRNA-ZFR的表达后，HepG2细胞的集落形成效率明显降低，细胞凋亡显著加速。生物信息学预测以及后续实验证实，肝细胞癌中过表达的circRNA-ZFR可通过ceRNA机制靶向结合miR-511进而阻断其与下游促癌基因AKT1的结合进一步正向调控AKT1的表达，最终激活AKT1/β-catenin信号通路，促进肿瘤细胞的增殖并抑制细胞发生凋亡[15]。作为MAP激酶信号传导途径中关键的组成成分，MAP2K1参与调控细胞增殖、分化以及基因转录等过程[16]。circRNA-ZFR于HCC肿瘤组织和细胞中异常高表达，过表达circRNA-ZFR后Hep3B的细胞活力以及侵袭迁移速度明显增强。进一步的研究结果表明，HCC肿瘤细胞中circRNA-ZFR与MAP2K1的表达水平呈负相关，并且circRNA-ZFR可通过互补结合序列靶向作用于MAP2K1；而MAP2K1过表达可显著抑制上调circRNA-ZFR对肿瘤细胞恶性生物学行为的促进作用[17]。

糖酵解可通过影响肿瘤微环境促进HCC的进展[18]。通过转染小干扰RNA特异性下调肿瘤细胞中circRNA-ZFR的表达后，circRNA-ZFR的下调显著降低Huh7细胞的葡萄糖摄取、乳酸生成能力和细胞内ATP含量；Huh7细胞增殖、迁移和侵袭能力由于circRNA-ZFR的下调出现明显的减弱。数据库筛选及双荧光素酶报告实验进一步确认，circRNA-ZFR与miR-375和miR-375与HMGA2(high mobility group AT-hook 2)存在相同结合位点；circRNA-ZFR通过靶向作用于miR-375来下调其表达，进而阻断miR-375与下游促癌因子HMGA2的结合；沉默circRNA-ZFR和转染miR-375 mimics对Huh7细胞葡萄糖摄取、乳酸生成能力的抑制作用在过表达HMGA2后明显减弱。综上，过表达的circRNA-ZFR通过内源性竞争吸附miR-375，进而调控促癌因子HMGA2的表达，最终通过促进HCC肿瘤细胞糖酵解途径实现促癌[19]。

2.8 CircRNA-ZFR与非小细胞肺癌

与癌旁正常组织相比，circRNA-ZFR在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)肿瘤组织中表达更高；并且circRNA-ZFR表达水平与患者不良预后密切相关。细胞功能学实验结果显示，circRNA-ZFR在肿瘤细胞中同样呈异常高表达；外源性沉默肿瘤细胞中circRNA-ZFR的表达后，细胞增殖、侵袭和迁移能力明显减弱；此外，G1期NSCLC细胞百分比明显增加，更多的细胞被阻滞在G1/S期的过渡阶段。进一步研究指出，circRNA-ZFR可通过ceRNA机制靶向作用于miR-377-5p，阻断其与下游靶基因NOVA2(NOVA alternative splicing regulator 2)的结合从而上调NOVA2的表达；过表达NOVA2可部分逆转沉默circRNA-ZFR以及miR-377-5p mimics对NSCLC细胞恶性生物学行为的抑制作用[20]。在体外，利用小干扰RNA特异性下调肿瘤细胞中circRNA-ZFR的表达后，NSCLC肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力由于circRNA-ZFR的下调表现出明显的减弱。在生物信息学预测的基础上双荧光素酶报告实验证实，circRNA-ZFR借助海绵吸附机制(miR-101-3p/CUL4B信号通路)调控肿瘤细胞的恶性生物学行为[21]。

在NSCLC临床耐药性的研究中，低表达circRNA-ZFR的A549细胞在使用顺铂后凋亡增加，提示细胞的顺铂耐药性下降；注射低表达circRNA-ZFR的A549细胞后，小鼠体内肿瘤的生长速率明显减慢，对顺铂的耐药性也发生明显下降。机制研究结果表明，circRNA-ZFR通过miR-545-3p/CBLL1轴上调CBLL1(cbl proto-oncogene like 1)的表达，进而影响NSCLC肿瘤细胞的顺铂耐药性[22]。紫杉醇耐药的NSCLC患者肿瘤组织和细胞中存在异常高表达的circRNA-ZFR；外源性沉默紫杉醇耐药的NSCLC细胞中，circRNA-ZFR表达后更多的肿瘤细胞停留在G0/G1期，提示细胞周期被阻滞；同时由于circRNA-ZFR的下调，更多的肿瘤细胞发生凋亡。深入研究发现，circRNA-ZFR与miR-195-5p以及miR-195-5p与促癌因子KPNA4(karyopherin subunit alpha 4)存在相同的结合位点；在肿瘤细胞中circRNA-ZFR靶向吸附miR-195-5p并阻断其与下游靶基因KPNA4的结合；过表达miR-195-5p以及敲低circRNA-ZFR的表达对紫杉醇耐药NSCLC细胞恶性生物学行为的抑制作用可被过表达的KPNA4部分逆转[23]。

3 CircRNA-ZFR异常低表达

对48例胃癌(gastric cancer, GC)患者肿瘤组织和细胞的定量检测结果显示：circRNA-ZFR在GC肿瘤组织和肿瘤细胞中呈异常低表达；circRNA-ZFR的表达水平与淋巴结转移及肿瘤临床分期密切相关。外源性上调circRNA-ZFR的表达后，肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显受抑；而过表达circRNA-ZFR后GC细胞凋亡率显著升高，并且停留在G1/G0期细胞占比明显增加。机制研究结果显示，circRNA-ZFR可海绵性吸附miR-130a/miR-107，通过调节下游抑癌因子PTEN(phosphatase and tensin homolog)的表达进而影响肿瘤细胞增殖、细胞周期和凋亡[24]。结直肠癌的研究中，circRNA-ZFR在肿瘤组织和细胞中呈低表达；显著减弱细胞增殖和侵袭迁移能力。进一步发现circRNA-ZFR可通过miR-532-3p/FOXO4轴调控结直肠癌的恶性生物学行为[25]。上述研究提示circRNA-ZFR在胃癌与结直肠癌中表达下调并作为抑癌基因发挥作用，这可能与肿瘤间的异质性或肿瘤自身特性有关，具体的原因以及分子机制有待后续进一步深入研究。

4 问题与展望

随着科学技术的发展，circRNA在人类病理生理过程中的调控作用正逐步被揭示。研究证实circRNA-ZFR在肿瘤发生发展中扮演着极为重要的角色：绝大多数恶性肿瘤中circRNA-ZFR呈异常高表达，并通过多种复杂的调控途径促进肿瘤的恶性生物学行为；而在胃癌以及结直肠癌中又可充当抑癌因子，对肿瘤增殖和侵袭迁移有一定的抑制作用；同时circRNA-ZFR异常表达又与患者的预后密切相关。然而，对于circRNA-ZFR在不同肿瘤中的差异表达及其在临床诊治中的作用仍有待进一步探索。深入研究circRNA-ZFR在人类肿瘤中的表达及作用机制将有助于恶性肿瘤的诊断、治疗和预后评估。