李建兵,包卫东
(1.甘肃省小陇山林业调查规划院,甘肃 天水 741020;2.甘肃省小陇山林业实验局 ,甘肃 天水 741020)
七叶树(学名:AeculuschinensisEunge),为甘肃省珍稀频危省级保护树种之一,在中国秦岭西段的小陇山林业实验局林区多有分布。七叶树是著名观赏树种,同时,还具有药用及经济价值,可供小工艺品及家具等用材。通过运用组织培养快繁技术,使其不仅具有遗传性状相对稳定、增殖快、繁殖系数高、产量高、品质好、生产周期短等特点,而且受气候、季节影响小,便于操作,可节省大量人力物力。笔者参与了七叶树组织培养工作,并对该技术进行了初步研究,归纳总结了一些成熟的做法和结论,以便在生产实践中予以推广应用。
通过对茎尖材料的无菌培养,研究器官分化和在离土培养条件下培养材料(外植体)的生长发育规律,以及影响这些过程的各种因素。
无菌操作装置是接种箱(超净工作台),内附空气过滤系统、光照系统、紫外灯。
七叶树组织和细胞培养室里,需要具有照明和控温设备,为七叶树外植体生长及发育提供所需要的环境,比如温度、湿度、光照、通风等。一般要求温度在25±1℃之间。光源一般采用白色荧光灯或自然光线,每天光照约16h,光强为200001x左右。还需要配备有常用的培养架,用于固体培养。
(1)三角瓶或烧杯(100ml,250ml,500ml,1L);(2)玻璃搅拌棒;(3)冰箱;(4)空调;(5)牛角勺;(6)剪刀;(7)器械架;(8)纯水水桶;(9)量简(25lm,50ml,100ml,1L);(10)容量瓶(100ml,500ml,1L);(11)刻度移液管(1kl,2ml,5ml,10ml);(12)药物天平;(13)磨砂口玻璃瓶; 用来对植物材料进行表面灭菌。(14)酒精灯;(15)无菌滤纸 ;(16)高压灭菌锅或家用乐力锅;(17)可调式电炉;(18)酸度计;(19)镊子;(20)解剖刀;(21)培养皿;(22)锥形瓶;(23)室内小推车。
为了能够彻底灭菌,将七叶树玻璃培养器皿和培养基分开进行,先对培养容器用高压蒸汽灭菌法消毒,再对培养基用常规法灭菌,也可将它们置于烘箱中在160℃~80℃下干热处理3h。无菌操作中使用的各种器械都必须进行消毒,方法是:将它们依次放在95%酒精中浸一下,然后放置在火焰上灼烧,待冷却后使用,操作期间还要消毒几次。
3.1.1 培养基的配制
采用MS(Murashige和Skoog, 1962)培养基。
3.1.2 培养基成分
实验中,七叶树组织培养采用的是MS培养基,培养基的pH值要求在5.8-6.0范围内。
3.1.3 培养基母液装瓶及灭菌
培养基母液配制好后,分别按规定吸取量吸取,加入琼脂、蔗糖混成1∶1溶液煮成培养基,然后进行分装入瓶.入瓶后要立刻用封口膜将容器口处理好,以确保不变干,不被污染。已经封装好的培养基放入高压锅中进行高温灭菌,温度控制在130~135℃之间,保持10min即可。
3.1.4 培养基的保存
经过3天预培养的七叶树培养基,灭菌完毕后,放置于防尘、避光、恒温处。
3.1.5 外植体处理
培养材料的采集,选用当年生嫩枝作为外植体(植物器官)。将采收下来的外植体先置于烧杯中,用流动的自来水冲洗20~60min,再用无菌水漂洗1~3次。把冲洗好的外植体放在磨砂口的玻璃瓶中,倾入70%(浓度)的乙醇没过外植体,并轻晃以除去附着物,经过10~20s将乙醇倒去,用无菌水冲洗。接下来再用配制好一定浓度的氯化汞溶液泡外植体5~10min。将消毒水倒出再注入无菌水,摇动数次后倒出,重复3次。灭菌后,将外植体从瓶中取出放于灭菌过的过滤纸上,把材料上的水吸掉等待接种。
3.2.1 接种操作
1)接种前器械必须进行消毒,方法是先用水洗净,再用牛皮纸包裹好放入高压锅内进行40~60分钟的灭菌。在进行接种时,先用70%酒精进行表面消毒,再用火灼烧、冷却。超净工作台应先用70%的酒精擦拭一遍,再用紫外灯照射20min。接种工作人员必须穿消过毒的工作服,戴消过毒的口罩,进入工作台前手要用70%酒精进行消毒。
2)接种时左手拿起三角瓶,右手轻轻取下封口膜,动作要慢,以免气流冲入瓶中造成污染。将三角瓶的口靠近酒精灯火焰上燎数下,将灰尘物等固定在原处,然后用镊子将外植体送入瓶中插在培养基上,将镊子放入消毒酒精中,再把封口膜在火焰上旋转灼烧一下,封上口,做好标记,材料接种完毕。
3)接种后3-7天内要每天检查,主要是看有无污染情况发生,细胞观察每隔3-5天看一次并记录结果。
3.2.2 初代培养
经过3-10天的培养,管苗会生出少量不定芽,发现后要做详细记录。同时适量添加一些营养元素,以提高出芽率。
3.2.3 继代培养
经过2-6周左右,可分化出大量的不定芽。当观察到七叶树外植体上的嫩茎长到一定高度时,就可以切割并转接到生根培养基上,进行生根诱导了。
3.2.4 试管苗出瓶
在生根培养基的诱导下嫩茎长出可进行移栽的根系,即可进行出瓶了。在七叶树试管苗出瓶之前,最好进行一些适应性处理,具体包括透气锻炼和脱去基质两个方面:
1)透气锻炼。把试管苗移放到要进行移栽的地方,以便适应外界的变化,随后把瓶口上的封口膜逐次打开,进行通风处理,使其适应生长地空气环境,使植株的成活率生长状况保持稳定。
2)脱去基质。管苗在移前还要把根系上粘着的培养基和水冲净,以免因感染细菌而导致根系发育受到影响,最后就可以将管苗移栽到经过灭菌处理的珍珠岩上或蛭石等基质中。
3.2.5 试管苗移栽
实验证明,用七叶树组培法繁育的幼苗不同于大田苗,必须经历一个炼苗的过渡期,才能适应外界环境,也才能更好地生长。
1)炼苗处理措施:通过控水、减肥、争光、降温等措施。
2)试管苗的炼苗技术:为了提高七叶树组培苗的成活率和保存率,必须采取炼苗措施。具体包括以下三个方面:对于准备移栽的试管苗在培养基中加入矮状素;并在移植前把试管苗放在室内高台处散射光强的地方;使幼苗经过5天的锻炼后再移栽。
对七叶树苗木进行组织和细胞培养是可行的,小陇山林区可以进行该技术的推广应用。在实验与应用过程中应注意以下事项:
1)对一个树种进行组培快速繁殖,是一个非常精密的系统工程,必须环环相扣。
2)在研究过程中必须严格执行相关技术规定和技术标准要求。
3)应按部就班进行。