蜡样芽孢杆菌分型方法的研究进展

孟庆磊，张玉良，赵东辉，贾伟娟，何云江，郗珊珊，陈云娇，王学理

（1内蒙古民族大学动物科技学院，内蒙古通辽 028042；2通辽市动物检疫技术服务中心，内蒙古通辽 028001）

0 引言

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种兼性厌氧型细菌，其革兰氏染色为阳性，该菌与炭疽杆菌、苏云金芽孢杆菌和韦氏芽孢杆菌等为一个种的成员。B.cereus对营养要求低且对外界不良环境适应能力极强，可抵抗物理因素和多种化学物质对其生长的干扰[1]。该菌对青霉素酶有极强的抵抗力且其十分耐热[2]。蜡样芽孢杆菌在土壤、植物、饲料和各类食品中均有存在，如各类乳制品、大米、面食小吃等[3-4]。国内外均有B.cereus引起食物中毒的报道，其可引起机体致病性感染如眼球炎、脐带炎和脑膜炎等[5-6]，最为多见的是引起食物中毒，致病性菌株可产生2种毒素（腹泻肠毒素和呕吐肠毒素）。呕吐肠毒素是环状十二肽cereulide；腹泻肠毒素主要是细胞毒素K(CytK)、蛋白性肠毒素溶血素BL(Hbl)和非溶血性肠毒素Nhe[7]。

B.cereus的检测、分型对于公共卫生的安全和该细菌病的防控意义重大，快速准确的对菌株进行分型还有利于菌株的溯源工作。B.cereus的分型有传统分型（噬菌体分型、血清分型和生化分型等）和分子分型（全基因组测序分型、脉冲场凝胶电泳分型和重复序列PCR分型等）两类方法。本研究以蜡样芽孢杆菌为研究对象，对其分型方法进行了综述，以期为B.cereus的检测和该细菌病的防控提供一定的参考。

1 蜡样芽孢杆菌的传统分型方法

在20世纪早期根据细菌的形态对其进行分型（例球菌、杆菌）。而后有了噬菌体分型、血清学分型[8]、抗生素耐药性分型[9]和传统生化分型[10]等方法。

噬菌体只有种和型的特异性，一种噬菌体只能裂解一种或几种相应的细菌，可用其鉴定细菌和对菌株实现分型。姚敬业等人使用噬菌体对B.cereus进行分型，从水中先后获取了13株蜡样芽孢杆菌噬菌体及对723株待检菌株(从国内的16个地区获得，包括602株食品株和121株食物中毒株)进行了分型，该批菌株被分成了41个型，C29、C30、C24、C27、C19和A4等型别的菌株数量较多，为该批菌株的优势菌株，食物中毒株分型率（分型率75%）明显比食品株分型率（分型率51%）高。噬菌体分型操作步骤繁琐且重复性较差，有一部分菌株未能分型成功，使用此方法对B.cereus分型的报道较少。

B.cereus的传统分型方法中生化分型占有主要地位，叶玲清等[11]依据GB 4789.14—2014食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验[12]的平板计数法将126个样本中检出的26个菌株分为7个型别（其中以9型为主）。陈惠玲等[13]对79株来源于食品的B.cereus进行生化分型，结果显示除19株不能进行分型，其余60株共分为10个生化型（以2型和9型为主）。传统生化分型可以为致病菌的分型提供一定的参考，但该方法分型过程难以实现自动化，结果重复性差，分型所需时间长。

2 蜡样芽孢杆菌的分子分型方法

2.1 多位点序列分型

多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是一种新兴的分子分型方法，由于该方法分辨率较高，目前在致病菌分型中应用较广。MLST分型是1998年提出的一种鉴定方法，该分型方法是以核酸序列为基础对菌株进行分型[14]。MLST多被用于蜡样芽孢杆菌群内各个种的区分，也可对呕吐型B.cereus进行识别[15]。许多基因在菌株的进化过程中会发生变异，多数致病菌中有7个管家基因保守，MLST法通过PCR法扩增持家基因的片段（长度约500 bp）并测定其序列，将每个位点的序列上传到MLST网站获得序列的等位基因编号，将各个菌株的等位基因编号按指定顺序排列，称为该菌株的序列型[16]。(sequence type，ST型)，对ST进行比较可以对比菌株之间的亲缘关系以实现分型，亲缘关系近的菌株其ST是相同的或者只有极少数基因有差距。吴霜等[17]将84株从婴幼儿乳粉加工的环境中分离到的B.cereus分成了24个ST型（有14个型在之前没有报道），系统分析后发现24个ST型与B.cereus、B.anthracis及B.thuringiensis的亲缘关系相对较近。陈惠玲等[13]使用MLST法将79株B.cereus分为48个ST型，但使用生化分型只分成10个型（其中19株不能分型）。MLST分型的分辨率相对较高，序列数据具有明确性以方便进行数据间的比对，但不适用于持家基因高度相似的菌株之间的分型，持家基因若过于相似则无法对菌株实现分型。

2.2 重复序列PCR分型

细菌基因组重复序列PCR(repetitive-element PCR，rep-PCR)技术是将基因组中的短重复序列作为引物，PCR扩增后对电泳结果进行分析并根据不同菌株基因组之间的差异[18]以实现分型。在细菌的基因组中发现，有10余种短重复序列可使用此方法进行PCR扩增，目前对肠道内细菌的基因间共有重复序列(Entero-bacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC)和基因外重复回文序列(Repetitive Extragenic Palindrome,REP)的研究较多[19-21]。Chaves等[22]使用rep-PCR将巴西分离的97株B.cereus菌株分为7个型别，1型所含菌株最多（含10个菌株，9株100%相似），这些菌株具有遗传多样性且含有ces基因及其他基因（这些基因为产肠毒素相关基因），可初步分出B.cereus的产肠毒素菌株。王君[23]在深圳、三亚等23个城市中抽取的1150份样品中有269份检出B.cereus，为研究遗传多样性，对广东地区分离的50株B.cereus菌株进行ERIC-PCR分型，将50株菌株分成47个型，其分辨力为0.996，当其相似系数为0.64时可以把50个菌株分成7个型。应用此方法进行分型发现所测菌株有较好的遗传多样性[24]，此方法弥补了传统分型方法操作困难、成本高等不足，为B.cereus菌株的分型提供了一定的基础。重复序列PCR分型的分辨率较高，但对于相同来源菌株的分型效果不好，相同来源的菌株有时会分型失败。

2.3 扩增片段长度多态性分型

扩增片段长度多态性分型(amplified fragment length polymorphism，AFLP)是一种检测基因组的限制性片段多态性的分型方法，AFLP法是将基因组DNA酶切成DNA片段后再将2个接头与基因组限制片段的两端相连，使用PCR扩增后依据电泳结果分型[25]。Ripabelli G等[26]应用该分型方法对15起食物中毒事件的21个分离培养物进行了分型，将21个分离培养物分成了16个型别，该分型方法还可以在血清型H1中区分出3种亚型（血清型H1是引发英格兰和威尔士B.cereus食品中毒事件的主要型别）。Tourasse等[27]通过多位点序列分型、AFLP和多位点酶电泳分型技术对2213株B.cereus分离株进行了分析，并检测到了疑似B.cereus的新菌株群，所测菌株与其他菌株的基因型一致。AFLP分型操作要求较高，但其准确度高[28]。AFLP分型具有重复性好、分辨率高且多态性强等优点，但使用AFLP法进行分型时，需要片段两端都与相应的接头片段连接方能有效扩增，否则会导致试验失败无法分型[29]。

2.4 随机扩增多态性DNA分型

随机扩增多态性DNA分型(random amplified polymorphic DNA，RAPD)是 Williams等[30]首先提出的。RAPD分型方法是以基因组DNA为模板，将模板与单一引物进行PCR扩增并根据电泳结果检测片段多态性，由片段多态性反映出基因组DNA多态性，分析电泳结果得到RAPD图谱，根据图谱可以实现分型。Oh等[31]应用RAPD法对从大米中分离得到的B.cereus分离株分型，结果显示菌株间存在广泛的多样性且在基因型水平上显示生米和熟米分离株之间存在一定的相关性，从生大米和熟大米中分离了126个分离株，测试了它们的潜在产毒性和实际产毒量，从大米产品中分离的菌株均具有产毒性，从生米分离的蜡样芽孢杆菌（13个RAPD谱图）比从熟米分离的蜡样芽孢杆菌（8个RAPD谱图）多，其中从生米和熟米分离的蜡样芽孢杆菌2个RAPD谱图是相同的。这些结果表明了RAPD法可分辨B.cereus的产毒素种类。Thorsen等[32]使用RAPD法将非洲自产豆酱中分离出的19株B.cereus分成了2个型，2个型中共7个菌株能够产生呕吐肠毒素，这个试验验证了RAPD法能区分出呕吐型B.cereus。汪娟等[33]认为在许多可用的DNA标记中，RAPD是操作最简单且经济成本低的分型方法，该方法可以在中等规模的实验室进行广泛应用，RAPD可以用于大部分基因组分型，但此方法也有一定的缺点，其稳定性和重复性相对较差，在使用时要注意控制试验条件。

2.5 脉冲场凝胶电泳分型

Schwartz等发明了一种新型凝胶电泳技术即脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)，这种电泳技术使DNA分子的分辨率可达2000 kb，此方法采用交替脉冲、垂直方向的电场，其中至少有1个电场是不均匀的，应用电脉冲的持续时间为1～90 s不等，以实现区间大小为30～2000 kb的DNA的分离。黄铭珊等[34]应用PAGE法对52株B.cereus菌株进行了分型和同源性分析，52个菌株被分成47种不同的PFGE型别，没有集中优势型别且有5株菌株来源不同但型别相同，此方法可基本满足分型需要。李文涓等[35]采用PAGE法对陕西省不同地区不同食品中采集到的123株B.cereus中的8株携带呕吐基因的菌株进行分型，各菌株的型别不同且结果显示没有聚集性，PAGE的分型结果标准且可在分子水平追溯菌株的同源性。王艳燕等[36]在5类食品的626个样本中发现197个样品含有B.cereus，使用PAGE分型将样品分成30个簇（共117个型别），菌株呈现多态性分布。PAGE分型法的重复性好且分辨率较高，可对不同地区、不同时间采集的食品进行源头的追踪[37]，但此方法的耗费时间较长且经济成本高，目前应用此技术对B.cereus分型的报道较少。

2.6 全基因组测序分型

全基因组测序分型(whole genome sequencing，WGS)可对菌株溯源且可对细菌引起的感染性疾病进行流行病学调查[38-40]。Carter等[41]使用终点PCR分析法、MLST法和WGS法将干燥食品中获得的64个B.cereus菌株分成13个产毒基因图谱，试验使用毒素基因PCR扩增并基于WGS法进行序列分析，首次显示了肠毒素的产生潜力并表明了基因组的多样性。WGS法分型的结果精确度高、通量低，该方法有很大的发展空间[42]。WGS分型具有很大的发展潜力，但要解决数据的计算、运输等问题[43]。为解决这些问题开发了以阿里云OSS为基础的WGS三级架构，此网络的应用使WGS分型方法使用更加方便，溯源网络的建立使此方法的发展前景更加广阔。

2.7 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分型

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOF-MS)分型具有操作简便、试验结果准确和试验过程自动化程度高等优点[44-45]。使用MALDI-TOF-MS法对菌株进行鉴定和分型的研究日益增多，此方法是通过检测微生物核糖体蛋白质的质谱数据后，与已知微生物的质谱数据进行比对鉴定，并以质谱数据为基础而进行分型。从培养的菌落取一小部分直接涂在靶板上，并覆盖基质溶液，只对其中少量的细胞进行必要分析。鉴定时通常以α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)与有机溶剂和水的混合物作为基质，将带斑点的混合物风干后插入质谱仪进行自动测量。将试验得到的光谱与已知的光谱库进行了比较后，可得到分型结果[46]。此方法可应用于对微生物的检测与鉴定，具有稳定、重复性好的优点，但此方法也有局限性，如菌种鉴定需与数据库进行数据匹配，菌种若未列入库中则无法被识别，在菌株分型中具有很好的分型能力，具有运转周期快、鉴定耗时短和通量高等优点[47]。使用此方法对B.cereus进行检测或分型的报道较少，Espinal等[48]使用MALDI-TOF-MS法对60株不同种的不动杆菌进行了区分，为B.cereus菌株使用此方法进行分型提供了参考依据。江连洲等[49]使用MALDI-TOF-MS法将41株B.cereus分成4个型别，与传统方法比较发现结果一致，但此方法的鉴定周期远比传统分型的周期短，此方法具有鉴定速度快、结果准确等优点，但要不断完善补充数据库以解决少数菌株无法分型的问题。MALDITOF-MS法还存在很多挑战，如样品的试验前处理、仪器操作是否标准、数据库中数据质量等因素都会对结果造成影响[50]。虽然MALDI-TOF-MS法有一些局限性，但其通量高、鉴定速度快且结果准确，这些优点表明此方法具有良好的发展趋势。

3 结语

关于B.cereus感染病例的报道逐步增多，与之相应的分型方法也逐渐发展成熟，对菌株进行分型可以为该细菌病的防控提供理论基础。本研究中所涉及的传统分型方法和分子分型方法都有其各自的优点及短板，需根据具体情况选择适当的方法对菌株分型，从而发挥每个分型方法的最大优势。各方法优缺点汇总见表1。MLST法可用于大部分菌株的分型，其应用范围较广，MLST多被用于蜡样芽孢杆菌群内各成员各个种的区分，也可对呕吐型B.cereus进行识别，但是对于持家基因相同的菌株不适合用MLST法分型（可能会分型失败），分型技术的完善会让MLST法在未来的菌株鉴定和分型工作中被更多的应用。rep-PCR法可以得到清晰稳定的DNA指纹图谱，在菌株的鉴定、分型等方面的试验中具有良好的发展前景，但易受其他因素的影响（如DNA模板浓度、退火温度等因素），需要更改变量进行重复试验以优化试验体系[51]。RAPD法操作过程最简单、成本低且可以在多数实验室中使用，此方法可触及基因组的大部分区域，无需事先对所研究的基因组进行了解，但需要在试验中注意片段两端都要与所测片段连接，否则会无法完成分型。AFLP法、PFGE法在对菌株分型时也具有一定的优点，但应用这2种方法对B.cereus分型的报道并不多见，这2种分型方法在试验中常与其他分型方法共同使用。WGS法和MALDI-TOF-MS法目前相比于其他分型方法还存在诸多不足，需进一步完善优化后才能逐步推广。对B.cereus分型的方法逐渐增多，且逐渐向低成本、高准确度和高分辨率等方面发展，未来的分型方法需具备操作过程简单、分型结果可靠和经济成本低等优点，各种分型方法还需进一步完善。选择适当的方法对B.cereus进行分型可以预防和控制该细菌所引起的疾病，并对该菌相关的研究工作具有重要意义，未来仍需在此方向进一步开展研究。

表1 蜡样芽孢杆菌分型方法的优缺点