Rudhira/BCAS3影响血管形成的机制及其与胚胎发育和临床疾病的研究

师向荣 郝晓莹 袁洁玲 高介芳

一、Rudhira/BCAS3的结构和功能

人类乳腺癌扩增序列3(breast carcinoma amplified sequence 3，即BCAS3)最早发现于乳腺癌中，在其他肿瘤如脑肿瘤中也有表达，不具有组织特异性，是与小鼠Rudhira 98%相同的一种细胞骨架蛋白[1]，有学者先后使用多种生物信息学预测工具对Rudhira蛋白的结构域或基序进行预测，包括：WD40结构域、BCAS3结构域、富含脯氨酸(P)、谷氨酰胺(E)、丝氨酸(S)、苏氦酸(T)的PEST基序、SxIP基序和磷酸化位点，这些结构域及基序是Rudhira蛋白发挥生物学功能的关键。其中，BCAS3结构域是组成Rudhira蛋白的结构域之一，其对于Rudhira发挥功能是充分必要的，如Rudhira蛋白的全长以及BCAS3结构域可以有效地共免疫沉淀微管蛋白并通过结合微管蛋白发挥其功能。

1.人类BCAS3的结构

BCAS3位于染色体17q23，全长600kb，含有24个外显子，编码913个氨基酸，最早发现BCAS3是在乳腺癌中，其命名也由此而来，BCAS3和BCAS4在乳腺癌中广泛过表达且融合，融合断裂点位于BCAS3基因的22号外显子和23号外显子之间[2]。BCAS3不仅在乳腺癌中的表达，也在脑肿瘤中表达[1]，不具有组织特异性。序列相似性分析显示，在核苷酸或氨基酸水平上BCAS3基因没有人类同源基因[2]，而与小鼠Rudhira基因有98%的同一性[1]。

2.小鼠Rudhira的结构

小鼠Rudhira位于染色体11C，即镁离子依赖的蛋白磷酸酶1D和T-box2转录因子之间，是编码928个氨基酸的一种细胞骨架蛋白，小鼠转录组鉴定了该基因的全长cDNA和编码序列，该cDNA是含有388个氨基酸(aa)的开放阅读框(ORF)，没有polyA尾[1]。Rudhira主要表达于内皮细胞[3]，在多种肿瘤来源的细胞系也有表达，如乳腺癌MCF-7细胞和宫颈癌Hela细胞等[1]。

Siva[1]和Joshi[7]等人先后使用多种生物信息学预测工具对Rudhira蛋白的结构域或基序进行预测，预测存在以下结构域，包括一些翻译后修饰：(1)WD40结构域：主要功能是通过蛋白质与蛋白质之间相互作用组装形成蛋白质复合体来调控各种各样的生物学功能，此外，WD40结构域能够组成β-螺旋桨结构，Joshi等人[7]使用蛋白质结构预测工具Phyre2在Rudhira蛋白的N-末端附近预测存在一个β-螺旋桨结构，而结构预测工具RaptorX则预测存在两个β-螺旋桨结构，其结果不一致，有待进一步研究；(2)BCAS3结构域：Rudhira蛋白发挥功能的主要结构功能区，例如Rudhira蛋白通过BCAS3结构域与微管(microtubules，MT)和波形蛋白中间体细丝(vimentin intermediate filaments，IF)结合，并促进MT-IF交联，进而调节细胞骨架结构，维持细胞形态、促进细胞运动；(3)富含脯氨酸(P)、谷氨酰胺(E)、丝氨酸(S)、苏氦酸(T)的PEST基序：参与蛋白质降解，如PEST基序缺失，显示出泛素蛋白酶体介导的蛋白质降解的易感性增加；(4)SxIP基序：含丝氨酸-任何氨基酸-异亮氨酸(I)- 脯氨酸的基序，介导Rudhira蛋白与末端结合蛋白EB1(一种微管正末端追踪蛋白即+ TIPs，调节微管动态性)结合并定位到微管末端，调控微管的动态不稳定性，进而参与微管介导的许多细胞活动，包括细胞极化、细胞运动、细胞有丝分裂等，如通过调控微管末端动态性促进细胞定向迁移；(5)磷酸化位点：Rudhira蛋白的磷酸化可能参与调节微管正末端蛋白(+ TIPs)的募集，进而调控微管动态不稳定性，但具体研究尚缺。

3. 人类BCAS3和小鼠Rudhira之间的关系

人类BCAS3是与小鼠Rudhira 98%相同的一种细胞骨架蛋白[1]。BCAS3结构域是组成Rudhira蛋白的结构域之一。Joshi等人[7]研究发现仅去除Rudhira蛋白上的含BCAS3结构域的片段，导致Rudhira蛋白功能丧失，表明Rudhira蛋白发挥功能需要BCAS3结构域。此外，Rudhira蛋白含有多个波形蛋白结合区，但微管蛋白结合区主要存在于含BCAS3结构域的片段中，Rudhira蛋白的全长以及BCAS3结构域可以有效地共免疫沉淀微管蛋白，表明Rudhira蛋白的全长和BCAS3结构域可以通过结合微管蛋白发挥其功能，BCAS3结构域对于Rudhira发挥功能是充分必要的。

二、Rudhira/BCAS3功能和相关机制

1.Rudhira/BCAS3的功能

Rudhira是一种动态调节的分子，可调节内皮细胞的迁移和发芽[3,6]。Rudhira的主要功能是由BCAS3结构域介导，与MT和波形蛋白中间体细丝(vimentin IF)相互作用，促进MT和Vimentin IF交联，维持MT动态性并促进Vimentin IF延伸，指导MT依赖的黏着斑(focal adhesion，FA)解聚，以调节细胞骨架动态重组及FA的转换，促进细胞迁移。

2.Rudhira/BCAS3和血管形成

血管形成包括细胞外基质、细胞-细胞、细胞-基质的局部重塑粘连，如细胞黏附、细胞外基质重塑等，此外，细胞极性的建立、血管内皮细胞迁移和内皮细胞管状结构的形成都是血管形成中的关键步骤[3]。

近期Shetty等人[3]研究发现Rudhira在血管形成及其相关过程中起作用，包括血管内皮细胞迁移、细胞黏附和细胞外基质重塑等。Shetty等人[3]在敲除小鼠Rudhira基因(KD)研究中的转录组分析显示Rudhira影响细胞黏附和细胞外基质重塑，在体外细胞侵袭试验测定中显示敲低rudhira(KD)的内皮细胞侵袭性下降，同一实验中，rudhira KD使细胞外基质如胶原蛋白基质的细胞黏附性降低。在体外球状体发芽血管生成测定中发现rudhira KD的内皮细胞未能发芽，表明Rudhira是内皮细胞发芽所必需的。这些都是血管形成的相关过程。

细胞极性建立和内皮细胞迁移是血管形成的关键步骤。微管组织中心(MTOC)和高尔基体重定向是极化细胞的既定标志。Rudhira通过在内皮细胞中建立细胞极性和诱导内皮细胞迁移而促进血管形成。Jain等人[6]研究发现Rudhira通过使MTOC和高尔基体重新定向而使细胞在伤口边缘方向上极化，表明Rudhira在细胞迁移前建立细胞极性方面发挥着重要作用。在同一研究中，Jain等人通过迁移轨迹分析发现Rudhira敲低的细胞迁移受损，并且在刮擦后细胞移动得更慢且随机地进入伤口边缘，表明Rudhira影响细胞迁移过程中的速度和方向。Shetty等人[3]研究也表明敲除rudhira基因的卵黄囊细胞迁移率下降和细胞迁移的方向丧失。

内皮细胞管状结构形成也是血管形成的关键步骤之一。Jain等人[6]通过体外血管生成实验研究发现敲低内皮细胞中Rudhira后，内皮细胞成管能力下降，表明Rudhira在内皮细胞管状结构形成中起重要作用。

3.Rudhira/BCAS3在控制细胞迁移过程中细胞骨架重塑的机制

细胞迁移过程中细胞骨架成分的相互作用是动态调节的，细胞骨架成分相互作用的调节可能在机体发育以及肿瘤血管生成中是重要的。Rudhira对于维持正常细胞骨架至关重要。Rudhira促进细胞骨架成分相互交联，是维持MT动态不稳定性和FA动力学所必需的。

(1)Rudhira/BCAS3与肌动蛋白

肌动蛋白丝，微管MT，中间丝(IF)和细胞骨架相关蛋白之间的紧密和复杂的相互作用导致细胞形态变化和黏着斑(FAs)动态重组，这对于定向细胞迁移是必需的。定向细胞迁移需要在前沿连续协调黏着斑FAs组装和解聚，并在后部释放附着物，FAs组装或解聚的异常对细胞迁移都是有害的。

Jain等人[6]使用双顺反子Rudhira过表达的构建体转染小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3细胞)作为实验组，将Rudhira siRNA转染的小鼠隐静脉内皮细胞系(SVEC)作为对照组，实验组应力纤维显著减少，并且丝状伪足延伸增加，结果表明Rudhira可以重组肌动蛋白，促进细胞迁移。

(2)Rudhira/BCAS3与MT和波形蛋白中间体细丝(IF)

MTs和Vimentin IFs在细胞中配合以进行有效迁移，虽然最初Vimentin IFs沿着MTs形成，但后来这些细丝为MT生长提供了模板[9]。此外，IF主要通过MT依赖性转运和肌动蛋白依赖性流动，暗示细胞迁移过程中广泛的细胞骨架交联和交叉调控[10]。已有研究表明[8]，缺乏细胞骨架连接蛋白(plectin)的小鼠在出生后2-3天死亡，说明细胞骨架成分之间相互交联对于胚胎发育的重要性。研究表明[7]，Rudhira通过其保守的BCAS3结构域直接与内皮细胞中MT和IF相互作用，促进MT-IF交联，维持MT动态不稳定性，促进细胞骨架重塑及FA转换，进而促进细胞迁移。

为了探索Rudhira在细胞迁移中起作用的可能机制，Joshi等人[7]利用Rudhira敲低(KD)的小鼠隐静脉内皮细胞系和非沉默对照(NS)的免疫定位显示，在Rudhira KD的内皮细胞中MTs未对齐并且在内皮细胞周边处弯曲，而Vimentin IFs较少，占据内皮细胞内较小的区域并且不延伸，仅存在于内皮细胞核周区域。Rudhira KD的内皮细胞在细胞皮层有厚的肌动蛋白束，表明细胞和基质黏附异常，进而导致异常的内皮细胞迁移。表明Rudhira KD导致细胞骨架严重紊乱和内皮细胞迁移异常。

(3)Rudhira/BCAS3与黏着斑(FA)

MT和F-肌动蛋白(即聚集的肌动蛋白)募集对FA组织和动力学至关重要[26]。FA组装是肌动蛋白驱动的，FA解聚需要黏着斑激酶(FAK)磷酸化、MT和细胞动力蛋白2[27]的参与。Joshi等人[7]研究表明Rudhira在MT介导的FA解聚中起作用，在Rudhira KD细胞中免疫定位显示FA大小增加，数量减少，表明FA动力学受损。这些数据证实了Rudhira在细胞骨架上具有主要功能，促进FA转换和细胞迁移。

三、Rudhira/BCAS3和胚胎发育

胚胎发育过程中存在着大量的新血管生成和重塑。Siva等人[1]通过小鼠RNA原位杂交的免疫染色在小鼠胚胎期6.5天(Embryo 6.5)和E7.5天未检测到Rudhira RNA和蛋白质，在E8.5天，Rudhira RNA和蛋白质在心脏区域低水平表达，在卵黄囊血岛和卵黄囊中胚层强烈表达，在E9.5天和E10.5天，于头部间充质、体细胞中胚层、耳部囊泡、少数主要血管和少数血细胞中检测到Rudhira RNA的表达。Shetty等人[3]研究了小鼠胚胎在可检测到Rudhira基因之前(E7.5)和之后(E8.5、E9.5)Rudhira基因缺失对胚胎发育的影响，结果发现在可检测到Rudhira基因之前与对照组相比胚胎发育无明显影响，而在可检测到Rudhira基因之后敲除小鼠胚胎Rudhira基因，E8.5天显示出小鼠胚胎背主动脉的结构异常，E9.5天显示胚胎发育迟缓，结果发现Rudhira可影响胚胎发育的不同过程，表明Rudhira可能对胚胎的多个发育过程至关重要。

Shetty等人[3]用抗PECAM1抗体整体免疫染色分析了敲除所有细胞中Rudhira基因及仅敲除内皮细胞Rudhira基因(Rudhira CKO)的胚胎，发现Rudhira CKO胚胎与敲除所有细胞Rudhira基因的胚胎有相似的表型，并且仅敲除内皮细胞Rudhira基因后，Rudhira的RNA和蛋白质水平显著降低，均表明Rudhira主要表达于内皮细胞中。在同一研究中，Shetty等人利用免疫染色、组织学分析以及形态学分析了敲除Rudhira基因的小鼠胚胎卵黄囊与胎盘的血管形成，结果发现Rudhira对于卵黄囊和胎盘的血管网络重塑是必不可少的。Rudhira影响胚胎血管形成，进而导致胚胎发育异常甚至是胚胎死亡。

四、Rudhira / BCAS3与临床疾病

目前一些研究显示[1,5-6]，Rudhira/BCAS3高表达于乳腺癌、胶质母细胞瘤、脑血管外皮细胞瘤和小脑成神经管细胞瘤等肿瘤，认为Rudhira/BCAS3在控制癌细胞极性和促进肿瘤转移中有潜在作用。除此之外，有研究表明[16，18，25]，BCAS3基因多态性与肾脏疾病易感性(如痛风)、原发性开角型青光眼、冠状动脉疾病发生相关。

1.Rudhira / BCAS3与肿瘤

Rudhira/BCAS3在肿瘤来源的细胞系如HeLa、MCF-7和内皮细胞系Py-4-1中表达，并且与乳腺癌进展有关[1,5]。Rudhira/BCAS3与转移性乳腺癌有关[2,4]，并且与乳腺肿瘤的分级和增殖有关[5]。在不同类型的人脑肿瘤中发现了BCAS3的高表达，包括胶质母细胞瘤、脑血管外皮细胞瘤和小脑成神经管细胞瘤[4,22]。目前已有学者提出新的见解，认为Rudhira在控制癌细胞极性和促进肿瘤转移中有潜在作用[6]。因此，Rudhira可能是控制血管疾病和侵入性肿瘤的潜在目标。

(1)Rudhira / BCAS3与乳腺癌

据Corrêa等人[20]研究，BCAS3在乳腺癌供体血浆中的表达水平高于健康供体，表明BCAS3蛋白质可作为潜在的乳腺癌标记物。BCAS3基因在乳腺癌细胞系(主要是ER细胞系)和大约10%的原发性乳腺肿瘤中的扩增进一步表明BCAS3参与乳腺癌进展[2]。此外，原发性乳腺肿瘤中BCAS3的过度表达与肿瘤分级和增殖有关[5]。BCAS3的最后两个外显子可以转移到乳腺癌中另一个常见扩增区域20q13，从而产生在MCF-7细胞中高度过表达的融合产物BCAS3-BCAS4[2]。在MCF-7细胞系中检测到的融合产物BCAS3-BCAS4(乳腺癌扩增序列3/4)，其伴侣基因BCAS3和BCAS4在乳腺癌中广泛过表达且融合[2]。有研究显示[21]，BCAS3- BCAS4、MED13-BCAS3基因融合已被证明是乳腺癌发生的高风险。

(2)Rudhira / BCAS3与脑肿瘤

Siva等人[1]前期在小鼠脑中发现多种Rudhira剪接变体，遂在后期[4]进一步研究了人体大脑组织，发现在不同类型的人脑肿瘤中检测出BCAS3大量表达，包括胶质母细胞瘤、脑血管外皮细胞瘤和小脑成神经管细胞瘤[22]。

分子途径的异常调节可导致组织异常生长甚至是恶性肿瘤的发生[22]。一些对于生长发育起重要作用的关键分子，其异常表达可导致恶性肿瘤的发生[23,24]。Rudhira / BCAS3在III级胶质母细胞瘤和其他癌症中的异常表达使其成为治疗这些疾病的主要靶点。Rudhira / BCAS3在脑肿瘤的异常高表达可能作为诊断脑肿瘤的标志物。

2.BCAS3基因多态性与非肿瘤疾病

(1)BCAS3基因多态性与肾脏疾病易感性

Okada等人[11]研究了一项与肾功能相关(包括血尿素氮、尿酸和血清肌酐的浓度，以及基于血清肌酐水平估计的肾小球滤过率)的全基因组关联研究的荟萃分析，确定了17个与肾功能相关的新的基因。其中，BCAS3基因与肾功能显著关联。Franceschini等人[12]分析了美国印第安人与肾功能相关遗传研究的数据，在荟萃分析中，证实BCAS3的内含子变体与尿白蛋白与肌酐比率显著相关。Lee等人[13]应用了与韩国人肾脏疾病相关的全基因组关联研究，通过比较与血清肌酐水平和肾小球滤过率(GFR)相关的遗传基因，发现BCAS3中的单核苷酸基因多态性(SNP)rs9895661同时与肾病的血清肌酐浓度和GFR相关。有研究显示[14,15]，BCAS3的三个SNP(rs9895661，rs9905274，rs11653176)与汉族男性人群的痛风有关。Sakiyama等人[16]研究也发现BCAS3中SNP rs11653176与痛风相关联，此外，BCAS3的SNP rs11653176的风险等位基因C可能增加肾脏尿酸盐再吸收的风险，导致血清尿酸(SUA)水平和痛风的风险增加。Köttgen等人[17]发现BCAS3的另一个内含子SNP rs2079742的表达与SUA水平有关。

(2)BCAS3基因多态性与原发型开角型青光眼

原发型开角型青光眼多与遗传因素相关，Ramdas等人[25]通过全基因组关联分析，确定了染色体17q23上的BCAS3基因对垂直杯盘比(视神经乳头中央的凹陷即杯区，视神经乳头即视盘，二者垂直径之比即垂直杯盘比)有影响，垂直杯盘比的改变参与开角型青光眼的发生。Springelkamp等人[19]进一步研究表明，BCAS3(SNP rs11651885)与视神经乳头杯区相关，参与原发性开角型青光眼的发生。

(3)BCAS3基因多态性与冠状动脉疾病

Nikpay等人[18]研究显示BCAS3中的前导内含子SNP rs7212798与冠状动脉疾病强烈关联。

五、总结与展望

Rudhira / BCAS3高表达于血管生成旺盛的内皮细胞，血管生成旺盛的内皮细胞较多存在于胚胎血管以及肿瘤血管，Rudhira / BCAS3通过促进细胞骨架成分相互交联，进而促进血管形成，已证实Rudhira / BCAS3缺失的小鼠胚胎血管形成异常，进而导致胚胎发育异常甚至是胚胎死亡。目前关于Rudhira / BCAS3与胚胎血管形成的研究主要在动物胚胎上，相关人体研究尚缺。而Rudhira / BCAS3在乳腺癌及脑肿瘤中的高表达，是否由于高表达的Rudhira / BCAS3促进血管新生而导致肿瘤发生，机制尚不清楚，有待进一步研究。中国人群BCAS3基因多态性与肾脏等疾病易感性的相关性研究，有助于发现与肾脏等疾病易感性相关的危险基因型，并有望作为分子标志物用于筛选肾脏等疾病的高危人群或易感个体。