肾上皮细胞损伤与肾结石Randall斑块形成

杨 雄，靳潇潇，何文强

(1.河南中医药大学, 河南 郑州 450046; 2.河南中医药大学第一附属医院, 河南 郑州 450003)

泌尿系结石是一种常见的疾病，晶体物质游离或附着在肾乳头上是结石形成的基础，研究发现全世界结石的发病率正在上升[1]。在结石形成因素里，代谢类相关疾病被认为是结石形成常见的危险因素[2]。肾结石(kidney stones)由有机物和晶体聚集组成，在尿液相关物质过饱和的情况下形成。草酸钙是大多数结石的主要成分，其中许多是在Randall斑块(Randall’s plaque)的磷酸钙基础上形成的，Randall斑块存在于肾乳头细胞表面。目前肾上皮细胞损伤与Randall斑块两者之间的关系并没有研究给予以说明。本文对近几年两者之间关系的研究现状展开综述，以便为草酸钙结石的临床诊疗提供相应的参考。

1 Randall斑块形成理论

在肾结石形成机制一系列学说中， Randall斑块学说目前得到普遍的认可。对患有肾结石病变的肾乳头研究时，发现特异性钙结石附着在Randall斑块基础上形成的[3]， 并证实了库克(Cooke CR)关于Henle环(Henle’s loop)基底膜参与Randall斑块形成的结论。Henle环由降支细段、升支细段和升支粗段组成，通过逆流倍增和交换机制从尿液中回收水和溶质，降支细段和升支细段上皮细胞较少，细胞器相对较少，因而代谢水平低。然而升支粗段上皮细胞较多，细胞的代谢活性较强，Henle环粗大的上升支在肾脏的水和电解质处理以及维持酸碱平衡中起着核心作用，并通过钠钾泵及Na+-K+-2Cl-同向转运体(Na+-K+-2Cl-cotransporter type2，NKCC2)发挥作用。Henle环升支粗段通过细胞旁途径对钙重吸收[4]，新近研究的结果表明钙敏感受体(calcium sensing receptor，CaSR)直接调节紧密连接蛋白claudin-14和claudin-16的表达[5]，进而促进对钙的重吸收。Henle环升支粗段钙敏感受体及紧密连接蛋白的缺乏，将导致高钙尿症和结石的形成。诱发Randall斑块成的两个关键因素是尿量和尿液成分，升高的尿钙刺激磷酸钙(calcium phosphate，CaP)晶体形成，该晶体破坏肾小管上皮细胞促进肾间质内聚集形成栓塞和斑块，或通过尿液排出体外[6]。尿液中草酸钙结晶、感染或其他原因引起肾上皮细胞的损伤，使Randall斑块暴露于异常尿液的环境中，导致斑块表面与尿液中的草酸、钙离子的结合，进而有利于草酸钙结石形成。Randall斑块是在肾小管上皮细胞下形成的沉淀物，上皮组织被破坏及晶体的形成是草酸钙结石形成的重要一步。随着时间的推移，持续暴露在这种环境中有助于晶体附着，并促进结石的生长和保留。

2 肾上皮细胞成骨样改变与斑块

通过对斑块形成的临床和实验研究发现，血管钙化与Randall斑块存在相似性形成机制。Randall斑块的形成机制可能与上皮细胞的损伤、缺氧、高渗等刺激有关，从而促进肾上皮细胞向成骨样细胞分化[7]。随着对尿液成分的深入研究，高草酸尿症、高钙尿症、低柠檬酸尿症和低焦磷酸尿症会造成肾上皮细胞处于异常环境中，促使肾上皮细胞向成骨细胞转化。通过对雄性使用羟基脯氨酸(hydroxy-l-proline，HLP)诱导高草酸尿症和小管内草酸钙晶体沉积的大鼠模型中[8],对全基因组分析发现上皮细胞脱分化为成骨细胞的病理改变，发现骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic proteins 2，BMP2)、相关转录因子2(related transcription factors 2，RUNX2)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)等相关因子增加。鉴于以上研究推测：黏附在肾小管细胞上的草酸钙晶体通过骨桥蛋白的参与而结合到细胞中，晶体细胞黏附的刺激损害了管状细胞中线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的开放，并产生氧化应激、凋亡和骨桥蛋白表达，从而造成肾上皮细胞的损伤。将人肾近端小管上皮细胞暴露于磷酸钙中[9]，在培养物中也诱导了CaP沉积。这些细胞聚集形成结节，以凋亡细胞和晶体沉积的形式存在，并表达一些成骨标志物，如RUNX2、骨连接蛋白、骨桥蛋白和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)。在用草酸钙处理体外肾上皮细胞模型和体内培养的小鼠肾结石模型中，骨桥蛋白表达量的增加与Randall斑块的形成有密切联系[10]。其中一些上调的基因产物在上皮细胞成骨样改变中起作用，包括骨桥蛋白和骨钙素等物质。骨桥蛋白是一种成骨性标志蛋白，也具有矿化调节剂的作用，在肾结石的形成中起这重要的作用。它既可以作为晶体成核和生长的抑制剂，也可以作为钙化晶体成核的促进剂，而且是动脉粥样硬化斑块、Randall斑块、结石和晶体中普遍存在的成分。这些研究进一步表明，尿液中草酸，钙离子可导致肾上皮细胞的损伤，并促进成骨样相关因子及蛋白质表达增加，使上皮细胞向成骨细胞转化，有利于肾小管上皮细胞基底膜形成钙化晶体和Randall斑块，为肾结石的形成提供条件。

3 活性氧和炎性反应与斑块

正常情况下细胞内同时存在生成活性氧(reactive oxygen species,ROS)的体系和拮抗其生成的抗氧化剂体系，当细胞内ROS生成增多，通过生物膜脂质过氧化、线粒体功能异常引起细胞的损伤，ROS的过度产生导致氧化应激，这与许多疾病有关。肾小管液中草酸钙和磷酸钙结晶的增加激活肾上皮细胞中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶的产生，NADPH氧化酶与p47phox等6种亚基结合，形成具有活性的氧化酶复合体，并促进大量活性氧(ROS)向肾小管上皮细胞的释放[11]。草酸钙等物质引起细胞氧化应激反应也可以通过线粒体膜电位的改变产生，进而导致细胞色素C释放到胞质溶胶中并导致细胞凋亡[12]。在探究条斑紫菜多糖(porphyra yezoensis polysaccharide,PYP)对草酸盐诱导的氧化应激介导的肾小管上皮细胞(HK-2)损伤的修复作用时，发现PYP降低了草酸盐介导的乳糖脱氢酶释放、活性氧生成和细胞内Ca2+的水平、线粒体膜电位的损失，进而修复受损细胞、抑制晶体黏附和聚集来抑制肾结石的形成[13]，PYP可作为一种抗氧化剂用来预防肾上皮细胞的损伤及结石的形成。以上研究表明，活性氧参与肾小管上皮细胞的氧化应激损伤，活性氧可以使线粒体膜发生异常，使跨膜电位降低，导致细胞发生凋亡。当晶体诱导肾小管上皮细胞发生凋亡时，晶体的黏附力显著增加促进Randall斑块的形成。因此，草酸钙晶体诱导的肾小管上皮细胞氧化应激损伤和凋亡在肾结石的形成中起着重要的作用。

在使用微阵列和免疫组织学来比较23例草酸钙结石患者(年龄和性别匹配)肾乳头状Randall斑块(renal papillary,RP)、非RP组织及7名对照组正常乳头状组织的基因表达。透射电镜显示RP内部和周围均有OPN和胶原蛋白表达[14]，RP组织中脂质运载蛋白-2(lipocalin-2,LCN-2)、白介素-11(interleukin-11,IL-11)、环加氧酶-1(cyclooxygenase-1,PTGS-1)、谷胱甘肽过氧化物酶-3(glutathione peroxidase-3，GPX3)、单核细胞向巨噬细胞分化(monocyte to macrophage differentiation，MMD)上调，这些基因与激活的丝裂原活化蛋白激酶、Akt/磷脂酰肌醇3激酶通路以及导致肾脏损伤和氧化应激的促炎细胞因子相关。与正常非斑块组织相比，Randall斑块肾组织中免疫细胞的数量和细胞凋亡水平也增加。这些发现表明肾上皮细胞发生炎性反应、氧化应激和凋亡与CaP晶体的沉积和Randall斑块的形成有关。

4 巨噬细胞与斑块

尿液中草酸、钙离子异常是肾结石发病的危险因素，可诱发肾上皮细胞的损伤，促进管腔内晶体的形成，附着的晶体可以通过尿液排出体外，也可以被保留并附着在肾上皮细胞上。在对乙二醇致大鼠钙性肾结石模型进行研究中发现[15]，小管内肾晶体沉积的数量在第6天达到峰值，并且在第15天检测不到，这一过程解释了正常肾小管具有晶体清除能力。对肾结石患者肾乳头组织中表达基因的分析显示，结石的形成与炎性巨噬细胞表型(也称为M1表型)相关的基因上调和抗炎性巨噬细胞表型(也称为M2表型)相关的基因下调有关[16]。初期暴露在晶体中会使巨噬细胞向抗炎表型分化，抗炎巨噬细胞通过溶酶体加工吞噬和破坏晶体。然而，长时间暴露在晶体中可能会使巨噬细胞向促炎表型分化，炎性巨噬细胞可产生大量ROS,进而诱导细胞释放炎性因子，这些反应的直接导致了肾小管上皮细胞的损伤[17]。因此，巨噬细胞在炎性细胞因子长期刺激下，使巨噬细胞向促炎性巨噬细胞分化。促炎性巨噬细胞增加的同时抗炎性巨噬细胞的减少将进一步维持炎性反应微环境，进而促进晶体成核和黏附，从而导致Randall斑块的形成。

5 长链非编码RNA与Randall斑块

随着对基因组的深入研究，大量的长链非编码RNA(long non-coding RNA，IncRNA)被发现，IncRNA的突变或失调与疾病的发生和发展有密切的关系。H19是最早鉴定和最具特征的长链非编码核糖核酸之一，研究表明H19参与炎性反应调节并诱导组织损伤[18]。在乙醛酸诱导的草酸钙肾结石小鼠模型中，长链非编码RNA-H19表达显著增加，并与HMGB1、TLR4和NF-κB信号通路表达炎性反应因子呈正相关[19]，炎性反应因子表达的增加诱导的氧化应激、NADPH氧化酶和肾小管上皮细胞损伤。H19被认为是一种炎性反应调节剂，在肾小管上皮细胞损伤及在晶体黏附中其促进作用。最近的研究发现，在一水草酸钙(calcium oxalate monohydrate，COM)处理的人类近端肾小管上皮细胞(HK-2)中有9种高表达的IncRNAs，其中长链非编码编RNA339(LINC00339)表现出最高的上调水平[20]，LINC00339在肾结石的形成中存在潜在作用。用草酸钙处理人近端肾小管上皮细胞建立体外肾小管损伤的细胞模型[21]，发现LINC00339有miR-22-3p的结合位点，且NLRP3的mRNA中包含miR-22-3p结合序列，NLRP3被认为是miR-22-3p的靶基因，进行荧光素酶报告分析以验证miR-22-3p结合LINC00339或NLRP3。LINC00339的表达水平升高，NLRP3炎性小体促进炎性因子增加，进一步增加肾小管上皮细胞损伤。肾上皮细胞的损伤可诱导炎性反应和巨噬细胞的发生，进而促进Randall斑块的形成。因此，发现H19、LINC00339可能是肾结石治疗中保护肾细胞的有效治疗靶点。

6 治疗

血脂异常(心血管疾病的一个重要危险因素)的患者患肾结石的风险很高。他汀类药物(抗感染和降低胆固醇药物)与结石形成风险降低相关，他汀类药物通过提高一氧化氮的生物利用度和降低氧化应激来保护内皮细胞，从而降低肾小管上皮细胞的损伤[22]。另一项研究表明使用他汀类药物的患者更有可能接受噻嗪类利尿剂治疗，噻嗪类药物作用于远端肾小管和近端小管，增加钙的吸收，从而减少尿钙的排泄，使钙盐在肾小管上的沉积减少[23]。这些药有可能是未来治疗和预防肾结石的重要策略之一。

最近一项结石病的免疫治疗发现[24]，促进巨噬细胞向抗炎表型的极化，将抑制炎性反应发生并减少了草酸钙晶体沉积。用ASC-J9(一种促进雄激素受体降解的药物)治疗高草酸尿大鼠中，与对照组相比晶体的量明显减少，雄激素受体通过增加微小核糖核酸miR-185-5p的表达间接调节M2极化因子巨噬细胞集落刺激因子1(colony-stimulating factor 1，CSF-1)的表达，miR-185-5p是一种小的非编码核糖核酸，负调节CSF-1的翻译[25]。因此ASC-J9作为一种结石治疗药物可促进M2极化并减少肾脏中的晶体沉积。然而此疗法仅在大鼠体内研究应用，还需要长期临床试验证明是否对肾结石的发生产生效果。

7 问题与展望

目前对于Randall斑块形成的学说众多，但是确切的形成机制尚未明确，而且研究基于对患者肾结石的检查以及动物和细胞培养模型所了解得到的，目前缺乏一种真正代表肾小管上皮细胞下斑块的草酸钙结石动物模型。Randall斑块与结石的形成是一个多步骤过程，其中肾上皮细胞损伤对结石形成具有重要的作用。然而肾上皮细胞的改变对Randall斑块形成的研究是一个初级阶段，还需要继续研究Randall斑块形成机制(代谢、基因及相关信号通路等方面)及对各种学说的验证。以ROS和NLRP3炎性小体相关信号通路为靶点介导的氧化应激和炎性反应作为细胞的防御机制，与结石的联系被越来越多的研究所证实。因此，未来针对相关通路和基因进行调控，可能有助于确定治疗方案和预防肾结石的发生。