高效液相色谱法同时测定食用油中维生素A和维生素E的方法

杜 杰， 林春兰， 郑绣蒨， 刘昌树

(佳格投资(中国)有限公司，上海 201103)

维生素A(VA)和维生素E(VE)是一类脂溶性维生素[1]，VA中的视黄醇活性物质和VE中的各生育酚可作为人体有益的功效成分[2]，维生素E具有人体抗氧化的功效[3]。其中最常见的4种维生素E有α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE[4]。VA不稳定，常以酯化物的形态存在，市面上常用的功效添加剂为维生素A醋酸酯。有研究使用相同前处理同时检测鱼肝油中维生素A、D、E的方法[5]。GB 5009.82—2016《食品中维生素A、D、E的测定》针对维生素A使用紫外检测器，而维生素E使用荧光检测器。前处理复杂，皂化提取需分开进样且前分析时间冗长。也有学者对于前处理做快速检测VA及VE并进行定量的方法[6]，但稳定性差。本方法采用高效液相色谱法同时测定VA和VE，利用液相紫外检测器的双波长进行分析[8]，进一步优化了液相色谱外标法的前处理过程，同时对不同食用油中VA和VE进行测定，并通过方法验证完善和确效分析方法的准确性，节约操作时间。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

食用植物油；无水乙醇(分析纯)；丙酮(色谱纯)；甲醇(色谱纯)；二丁基羟基甲苯BHT(分析纯)；α-VE CAS号10191-41-0，纯度≥96%、 β-VE CAS号148-03-8，纯度≥96%、 γ-VE CAS号54-28-4，纯度≥96%、 δ-VE CAS号119-13-1，纯度≥96%；VA醋酸酯CAS号127-47-9，纯度≥95%。

1.2 仪器与设备

DHG-9420A电热鼓风干燥箱，HWS-12型电热恒温水浴锅：KQ-300E超声震荡仪，TDL-5-A离心机，UV-1800紫外分光光度计，LC-VWD Agilent 1260高效液相色谱仪配紫外检测器。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

VA醋酸酯母液配制：准确称取0.2 gVA醋酸酯标准品，用0.1%BHT甲醇溶液溶解后，转移入10 mL容量瓶中，定容至刻度，涡旋2 min，混匀，超声3 min。此溶液中VA醋酸酯质量浓度为20 mg/mL，在-20 ℃下避光保存，有效期180 d。

VA醋酸酯标准储备溶液配制：准确吸取VA醋酸酯母液(20 mg/mL)0.1 mL于10 mL容量瓶中，用0.1%BHT甲醇定容至刻度，涡旋2 min，混匀，超声3 min。此溶液中VA醋酸酯质量浓度为200 μg/mL，在-20 ℃下避光保存，有效期15 d。

VE母液配制：分别准确称取α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE各100 mg，用无水乙醇溶解后，转移入10 mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液质量浓度为10 mg/mL。将溶液分装转移至棕色试剂瓶中，在-20 ℃下避光保存有效期180 d。

VE标准储备液配制：吸取标准储备液(10 mg/mL)1 mL用无水乙醇溶解后，容量瓶中定容至10 mL，定容至刻度，此溶液质量浓度为1 mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中在-20 ℃下避光保存，有效期15 d。

1.3.2 油脂样品前处理

准确称取充分混匀的油样2 g，精确到小数点后4位，于10 mL容量瓶中。用丙酮定容至10 mL，涡旋2 min，混匀，超声振荡3 min，过0.22 μm有机滤膜，HPLC分析。

1.3.3 高效液相色谱条件

HPLC：Agilent 1260；管柱：Athena C30，长度250 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm；流速：0.8mL/min；进样量：10 μL；柱温20 ℃；紫外检测器波长：325 nm和294 nm 双波长；洗脱时间：30 min；流动相∶甲醇∶水，梯度洗脱时间见表1。

表1 不同时间的VA和VE标准曲线

1.3.4 计算

式中：X为试样中VA和VE的含量/μg/100 g；P为根据标准曲线计算得到的试样中VA和VE的浓度/μg/mL；V为定容体积/mL；f为换算因子(VA醋酸酯:f=0.872；VE:f=1)；100为试样中以每100 g计算的换算系数；m为试样的称样量/g；a为实际浓度/校正浓度。

VE含量=α-VE含量+0.5β-VE含量+0.1γ-VE含量+0.01δ-VE含量。

1.3.5 浓度较正

取VA和VE标准储备溶液100 μL于10 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，混匀，用1 cm石英比色皿，以无水乙醇为空白参比[8]，测定其吸光值，试液中VA和VE的浓度计算公式：

X=A×104/E

式中：X为VA和VE标准稀释液质量浓度/μg/mL；A为维生素稀释液的平均紫外吸光值；104为换算系数；E为维生素1%比色光系数，各维生素在乙醇相应的比色吸光系数见表2。

表2 各目标物的波长以及比色光系数

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的建立

根据液相色谱紫外检测器双波长分析[9]，利用标准品储备液(VA醋酸酯、α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE)进行不同浓度下标准曲线的绘制，不同时间的VA和VE标准曲线见表3。

表3 不同时间的VA和VE标准曲线

2.2 专一性、精密度和回收率

2.2.1 专一性(鉴别实验)

HPLC分析VA和VE的含量，标准品的保留时间在294 nm下32.12、29.49、28.80、26.07 min分别有α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE等VE组分，并保留时间在325 nm下13.77 min，有VA醋酸酯组分出峰。葵花籽油及玉米油VA和VE的保留时间与标准品保持一致，VA醋酸酯高效液相色谱图和VE生育酚高效液相色谱图如图1所示，仪器方法所需时间变化如图2所示。

图1 325 nmVA醋酸酯高效液相色谱图

图2 294 nmVE各组分高效液相色谱图

使用同时测定仪器方法进行分析，可使分别测定的分析总时长从每一针65 min减少到40 min，大大节约了分析时间，提高了检测的效率，见表4。

表4 同时检测仪器方法的优势

2.2.2 样品精密度

重复实验样品不同植物油进行分析(n=6)，VA含量葵花籽油平均735.58 μg/100 g，玉米油平均672.06 μg/100 g，组间VA含量RSD分别为0.84%和1.39%，VE含量以α-TE(α当量)葵花籽油平均53.70 mg/100 g，玉米油平均25.52mg/100 g，组间VE含量RSD分别为2.01%和3.41%，综合重复性实验，结果显示精密度良好，见表5～表11。本方法对VA和VE的分析具有良好的精密度和重复性。

表5 葵花籽油样品精密度分析

表6 玉米油样品精密度分析

表7 橄榄油样品精密度分析

表8 大豆油样品精密度分析

表9 菜籽油样品精密度分析

表10 芝麻油样品精密度分析

表11 花生油样品精密度分析

2.2.3 样品回收率

称取样品分别添加低、中、高3个加标水平的标准品进行实验，计算样品含量与加标后含量的偏差，回收率=(加标后测定值-样品本底值)/加标量×100%。不同加标水平的VA和VE回收率见表12，样品中VA醋酸酯、α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE回收率范围分别为95.8%～104.4%、96.2%～101.9%、98.2%～107%、103%～112%、98.5%～101%，回收率范围满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》。

表12 不同加标水平的VA和VE回收率

2.2.4 检出限(LOD)和定量限(LOQ)

将样品用丙酮配置成一系列浓度的溶液，按检测方法制备、测定并进行含量分析，直至分析峰面积低于S/N范围时，选择前一样品浓度，分析3次后确认满足检出限和定量限范围。计算色谱图的S/N比。其中S为响应信号值；N为噪声值。S/N为3∶1的浓度为最低检出限；S/N为10∶1的浓度为最低定量限，VA和VE的检出限和定量限见表13。

表13 VA和VE的检出限和定量限

2.3 油样中VA和VE的检测

利用本方法对不同植物油中VA和VE进行测定。对葵花籽油检测结果可知，葵花籽油中检测出α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE等4种VE，其中α-VE含量最多，δ-VE未检出。葵花籽油样品中VE(α-TE)的含量为(54.33±2.92)mg/100 g，葵花籽油中VA含量为(735.58±3.86)μg/100 g。玉米油的检测结果显示，玉米油中检测出α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE等4种VE含量，其中γ-VE含量最多，β-VE未检出。玉米油中VE(α-TE)的含量为(24.78±1.36)mg/100 g，玉米油中VA含量为(676.75±2.15)μg/100 g，其他植物油含量见表14。

表14 不同植物油中VA和VE含量

3 结论

利用液相色谱法测定食用油中VA和VE，由于标准物质VA醋酸酯以及VE的紫外吸收波长不同[10]，利用现代液相色谱仪器的优势，紫外检测器双波长的选择，通过双波长检测同时测定了VA和VE的各组分。实现节约测试时间和同种样品同步化处理[11]。实验由标准曲线外标法定量，丙酮溶解油中维生素物质，操作简易。实验表明，该方法的专一性强、VA的精密度RSD为0.84%～1.39%，回收率范围在95.8%～104.4%；VE的各组分精密度RSD为2.01%～4.14%，回收率范围在96.2%～112%。本方法也可应用于测定食用油中VA和VE。测得葵花籽油VA含量(735.58±3.86)μg/100 g，VE的含量为(54.33±2.92)mg/100 g；玉米油VA含量(676.75±2.15)μg/100 g，VE的含量为(24.78±1.36)mg/100 g。通过实验条件测定和方法验证，建立了一个有效同时测定食用油中VA和VE的方法，该方法相较于标准方法更适用于食用油产品的测定，减少萃取和皂化多过程中对样品维生素物质的干扰，节约操作时间和溶剂。相较于分别利用液相色谱法测定单一VA和VE进行2次处理2次上机，节约了成本，具有步骤简单，重复性好精密度高等特点。该方法可以应用于不同油脂中VA和VE的含量分析，提供优质功能性和营养化诉求的研究依托，为进一步提升油脂行业的检验检测和健康厨房粮油趋势提供了参考。