基于中空纤维-固相微萃取-高效液相色谱法测定环境水样中4种非甾体抗炎药残留

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

安捷伦1200高效液相色谱仪(美国，Agilent公司)；FTIR-8400傅里叶变换红外光谱仪(日本，岛津公司)；S-3500N扫描电镜(日本，日立公司)；TG16-WS台式高速离心机(湖南湘仪)。

美洛昔康(MEL)、吡罗昔康(PIR)、吲哚美辛(IND)和双氯芬酸钠(DIC)对照品购自中国食品药品检定研究院。精密称取PIR、IND和DIC对照品约10 mg，MEL对照品5 mg分别置于10 mL容量瓶，加甲醇溶解后定容，得到各待测物质的对照品储备液，待用。鳞片石墨购于青岛金日来公司；实验用水均为去离子水。甲醇、乙腈均为色谱纯；H3PO4、KMnO4、HCl、H2SO4等均为分析纯。

自来水水样采集自河北医科大学实验室，环境水样取自河北石家庄民新河，所有样品于玻璃瓶中4 ℃保存。

1.2 氧化石墨烯-中空纤维固相微萃取

1.2.1 氧化石墨烯的合成按照Hummers法[21]制备氧化石墨烯，步骤如下：将K2S2O4、P2O5置于烧瓶后缓慢加入适量H2SO4，搅拌均匀，加鳞片石墨，继续搅拌30 min，然后在80 ℃条件下反应4 h，所得固体低温烘干即为预氧化产物。称取适量预氧化产物置圆底烧瓶中，加适量H2SO4、KMnO4，搅拌30 min，在35 ℃条件下反应8 h，待反应结束后加重蒸水、H2O2，搅拌30 min转移至离心管，以4 000 r/min的速度离心20 min，弃去上清，洗涤沉淀至中性，干燥，即得氧化石墨烯(GO)。实验前，采用红外光谱仪和扫描电镜对其结构进行表征。

1.2.2 SPE装置的制备精密称取5.0 mg GO，填充至长度1 cm HF中，两端热封，即为GO-HF-SPME装置。实验前，采用甲醇-水(体积比为1∶1)清洗，活化GO-HF-SPME装置。

1.2.3 GO-HF-SPME将GO-HF-SPME装置置于20 mL样品溶液(pH=3.0)中，在转速500 r/min条件下搅拌30 min，然后将GO-HF-SPME装置转移至1.5 mL离心管中，加入1 mL甲醇(含0.5%三乙胺)，在转速8 000 r/min的条件下离心15 min，重复3次，收集洗脱液浓缩蒸干后，残渣用50 μL流动相复溶，涡旋、混匀，即得供试品溶液。

1.3 色谱条件

采用Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-水(含0.2%三乙胺，用H3PO4将pH值调至3.5)=33∶67(体积比)为流动相，在柱温35 ℃，流速1.0 mL/min，波长254 nm条件下进行色谱分析，进样量为20 μL。

2 结果与讨论

2.1 GO结构表征

由图1红外光谱图可知在1 735 cm-1,1 050 cm-1and 3 475 cm-1处有强吸收峰，分别与C=O、C-O和O-H相关，而1 640 cm-1处峰是由O-H弯曲振动以及环氧基、羧基和骨架环振动引起的，因此，上述结果表明GO表面存在丰富的含氧官能团，石墨烯成功被氧化。通过扫描电镜观察GO的固体粉末的形态，可见典型的片状结构，且表面较为光滑、平整。

2.2 GO-HF-SPME条件优化

基于HF 10 kDa截留分子量特性以及GO的强吸附能力，本实验建立了GO-HF-SPME方法，分别优化了GO质量、HF长度、样品溶液pH值、搅拌速度、萃取时间和解吸条件等参数，所用模拟样品溶液所含4种待测物的浓度均为500 ng/mL。

2.2.1 GO质量及HF长度实验发现每1 cm的HF可包裹5 mg的GO，制备长度为1 cm的GO-HF-SPME装置，分别考察其数量为1、2、3、4时的萃取效率。结果表明：GO质量为15 mg时，萃取效率达到最大值，之后不再明显增加。因此，选择的GO质量为15 mg。

确定GO的质量为15 mg后，比较不同长度(1 cm×3和3 cm×1)HF的萃取能力。结果表明：HF长度为1 cm时，GO-HF-SPME装置对待测物的萃取效率更佳。所以，最终样品前处理过程使用3个长度为1 cm的GO-HF-SPME装置。

2.2.2 样品溶液pH值的影响样品溶液的pH值会影响待测物的电离形式发生变化，且与萃取效率相关。MEL、PIR、IND和DIC的pKa分别为4.08、6.3、4.5、4.0，因此考察了样品溶液pH值分别为1、3、5、7时的萃取效率。由图2结果可知样品溶液的最佳pH值为3.0。

图2 pH对萃取效率的影响(n=3)Fig.2 The effect of pH on the extraction efficiency (n=3)

2.2.3 萃取时间实验考察了不同萃取时间(10、20、30、40 min)对萃取效率的影响，结果表明：当时间大于或等于30 min时，萃取效率不再增加。因此，萃取时间选为30 min。

2.2.4 搅拌速度考察了不同搅拌速率300、400、500、600 r/min对GO-HF-SPME萃取效率的影响。结果表明：在搅拌速率为500 r/min条件下，待测物的萃取效率最高，而当搅拌速率为600 r/min时，萃取效率降低，这可能是由于搅拌力大于待测物与GO之间的吸附力，导致待测物被吸附量降低。因此，选择500 r/min为最佳搅拌速度。

2.2.5 解吸条件的考察本实验中4种待测物均为酸性化合物，分别考察以不同浓度三乙胺(0.2%、0.5%、1.0%)-甲醇作为洗脱剂的影响。当三乙胺浓度为0.2%时，萃取效率最低；三乙胺浓度为1.0%时，萃取效率最高。然而，HF在强碱性样品溶液中易变性，导致GO-HF-SPME重复使用性较差。因此，以1 mL含0.5%三乙胺的甲醇作为洗脱剂。

在解吸过程中，洗脱循环次数是获得待测物良好回收率的重要参数。考察了不同的洗脱次数(1、2、3、4)，结果表明当洗脱次数为3时，待测物的量不再明显增加。

2.2.6 GO-HF-SPME重复利用次数按照上述已优化的最佳萃取条件，采用同一GO-HF-SPME装置反复萃取5次，HPLC进样分析后，RSD为9.7%，倘若反复使用6次，其RSD大于15%。因此，GO-HF-SPME装置反复利用次数尽量控制在5次范围内。

2.3 方法学验证及样品含量测定

2.3.1 线性关系及重复性配制成PIR、IND、DIC和MEL浓度分别为10、50、100、500、1 000 ng/mL的水溶液样品，按照“1.2.3”条件处理并进行HPLC分析，记录峰面积，与其浓度进行线性回归。结果表明：四种待测物在10～1 000 ng/mL范围内线性关系良好，各待测物的定量限(S/N=10)和检测限(S/N=3)分别在0.8～2.5 ng/mL、0.2～0.8 ng/mL范围内(表1)。

表1 方法学验证结果Table 1 The results of analytical method validation

以4种待测物浓度均为100 ng/mL的加标样品溶液作为分析对象，按照“1.2.3”条件重复萃取6次，考察该方法的重复性，结果显示RSD均不高于5.6%，表明本实验建立的方法重复性良好。

2.3.2 回收率及样品测定配制高中低三个浓度的加标样品溶液(MEL、PIR、IND和DIC浓度：10、100、500 ng/mL)进行加样回收率试验。所有样品均按照“1.2.3”条件萃取后进行HPLC分析，实际样品未检出MEL、PIR、IND和DIC，加样回收率在95.4%～102.5%范围内，RSD%<7.5(表2)。上述结果表明：本实验所建立的GO-HF-SPME联用HPLC法准确、可靠。

表2 4种非甾体抗炎药的加样回收率和相对标准偏差Table 2 Relative recoveries and relative standard deviations(RSD5) of target analytes

2.3.3 GO-HF-SPME的富集作用测定4种待测物混合对照品样品溶液(1 000 ng/mL)，环境水水样以及加标样品溶液(100 ng/mL)，经“1.2.3”处理后进样分析。结果显示，PIR、MEL、IND和DIC的富集倍数分别为20、55、50和103倍。所以，GO-HF-SPME对PIR、MEL、IND和DIC有较强的富集作用，可显著提高分析灵敏度。

2.4 与其他方法比较

本文所建立的GO-HF-SPME方法与以往类似的报道进行比较(表1)，其纯化、富集效果佳，且准确、可靠，灵敏度与LC-MS[22]检测水平相当。

表3 本研究与已有文献的对比Table 3 Comparison of the current work with other previous methods for analysis of NSAIDs

3 结论

本研究建立了一种GO-HF-SPME联用HPLC的方法用于分析环境水样中痕量MEL、PIR、IND和DIC。该方法将HF与GO相结合，并根据待测物的pKa值选择最佳的洗脱剂，在最佳萃取条件下获得MEL、PIR、IND和DIC的富集倍数在20～103范围内，加样回收率介于95.4%～102.5%间，因此，本研究所建立的GO-HF-SPME联用HPLC方法灵敏度高、且准确可靠，适用于分析环境水中4种非甾体抗炎药的残留。