GATA3、IL-13基因多态性和IL-13水平与小儿结核病易感性的关系研究

杨英阁

河南省南阳医学高等专科学校第一附属医院，河南南阳 473052

小儿结核病是指16岁以下的儿童所患的结核病，与成人结核病一样，也是由结核分枝杆菌引起，结核病在小儿呼吸系统疾病中发病率高达5%，尤其是在新生儿阶段若治疗不及时极易威胁生命安全[1-2]。影响小儿结核病的因素较多，除了外界环境的接触外，机体本身的易感性也逐渐成为近年来研究的热点，其中基因多态性能够反映出同种人群对同种疾病的不同患病风险[3-4]。GATA3-白细胞介素(IL)-13基因通路被报道与肺部疾病相关，包括哮喘、支气管哮喘等[5-6]，但是关于该基因通路与结核病，尤其是小儿结核病的研究较少。因此，本研究从2个关键基因GATA3和IL-13入手，重点分析其单核苷酸多态性(SNP)与小儿结核病易感性的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 随机选取2019年12月至2020年12月于本院诊治的根据2017年版《中华人民共和国卫生行业标准肺结核诊断》标准，痰培养抗酸杆菌阳性并结合影像学确诊为肺结核的414例小儿结核病患儿作为观察组，另选取456例同期来本院诊治的无肺结核感染的上呼吸道感染患儿作为对照组。观察组中，男242例，女172例；年龄1～14岁；平均体质量(33.21±13.21)kg；血压正常406例；血糖正常410例；发热411例。对照组中，男264例，女192例；年龄1～14岁；平均体质量(34.32±14.44)kg；血压正常432例；血糖正常455例；发热446例。所有患儿及家属均了解本研究的情况，并在知情同意书签字。本研究经本院医学伦理委员会批准。两组性别、年龄、体质量等比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1基因组DNA的提取 用含乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)的抗凝管采集每例患儿5 mL全血。使用Omega Mag-Binds Forensic DNA Kit 试剂盒(美国Omega公司，生产批号：20101109)提取血液的基因组DNA，完成后用ND2000型nanodrop(美国Thermo Fisher公司)测定DNA的浓度和纯度，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2聚合酶链反应(PCR)进行单核苷酸多态性(SNP)分型 使用Oligo6.0设计SNP位点处的引物序列及其Taqman探针序列，见表1，引物合成由上海生工生物公司完成。将1 μL的DNA溶液和配制好的1.2 μL引物溶液(包括上、下游引物，探针引物各0.4 μL)加入到预先配制好的17.8 μL的TransStart Probe qPCR SuperMix(北京全式金生物公司)中，轻微振荡混匀，放入bio-rad CFX96荧光定量PCR仪中，反应条件为94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。实验结果由仪器自带软件生成。每个样品做3个复孔，阴性对照使用焦碳酸二乙酯(DEPC)水，阳性对照使用含有该序列的阳性质粒(由上海生工生物公司合成)。基因型的判定：靠近FAM横坐标为野生纯合型，靠近VIC纵坐标为突变纯合性，位于靠近45°线的位置为杂合型。

表1 SNP引物序列

1.3酶联免疫吸附试验检测血清中IL-13水平 取观察组患儿的血清约1 mL，向96孔板中滴加标准品。样品孔中加入样品，每个样品3个复孔。混匀，用封板膜封板后置37 ℃温育30 min，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外，混匀，用封板膜封板后置37 ℃温育30 min。每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃避光显色15 min后每孔加终止液50 μL，终止反应。以空白空调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度。

2 结 果

2.1GATA3基因rs422628位点和IL-13基因rs20541位点的基因分型结果及其分布频率 所有待测的患儿均得到了明确的基因分型结果，见图1。在研究人群中，观察组GATA3基因的rs422628位点TT、TC和CC 3种基因型频率与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)；观察组IL-13基因的rs20541位点GG和GA两种基因型频率与对照组比较差异均无统计学差异(P>0.05)，但是AA基因型频率与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。

表2 基因分型的频率分布

注：A为rs422628位点的基因分型结果，方形图示为TT基因型，圆形图示为CC基因型，三角形图示为CT基因型；B为rs20541位点的分型结果，圆形图示为GG基因型，方形图示为AA基因型，三角形图示为AG基因型。

2.2rs422628位点不同模型分析小儿结核病的患病风险 显性模型(TC+CC/TT)的OR值为1.100(P=0.950)，隐性模型(CC/TT+TC)的OR值为1.210(P=0.757)，超显性模型中(TT+CC/TC)的OR值为0.981(P=0.920)。见表3。

表3 rs422628位点不同遗传模型分析小儿结核病的患病风险

2.3rs20541位点不同模型分析小儿结核病的患病风险 显性模型(AG+AA/GG)的OR值为1.746，P=(0.057)，隐性模型(AA/GG+AG)的OR值为3.349(P=0.008)，超显性模型(GG+AA/AG)的OR值为1.018(P=0.944)，见表4。

表4 rs20541位点不同遗传模型分析小儿结核病的患病风险

2.4rs422628和rs20541位点联合作用与小儿结核病患病的关系 2个SNP位点同时发生纯合突变的携带CC基因型和AA基因型的儿童，观察组有19例，占4.6%，对照组有1例，占0.2%，两组比较差异有统计学意义(P=0.043)，与未突变的野生纯合型(TT+GG)比较OR值为28.500。见表5。

表5 rs422628 和rs20541位点联合作用基因型的频率分布及其OR值

2.5观察组和对照组IL-13水平比较 观察组血清IL-13水平高于对照组(P<0.05)，见图2。

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.6不同IL-13基因分型患儿IL-13水平比较 携带AA基因型患儿的血清IL-13水平高于携带AG和GG基因型患儿(P<0.05)，见图3。

注：与AA基因型比较，**P<0.05。

3 讨 论

小儿结核病是由外界结核分枝杆菌入侵体内造成的，既与外界的环境因素有关，也与自身体质和免疫力相关[7-8]。目前，关于免疫力的提高，除了养成良好的生活习惯和饮食补充身体必需微量元素外，并无实质性的有效措施。对于16岁以下的儿童，免疫力较差，容易受到外界细菌和病毒的侵入，因此，小儿结核病与儿童的免疫力是直接相关的[9-10]。影响免疫力的因素也有很多，目前受学者广泛关注的是免疫因子信号传递通路的相关研究，免疫因子是免疫系统的直接信使，它们可以通过刺激或激活免疫细胞的活性来杀灭体内入侵的病毒和细菌[11-12]。

GATA3属于锌指结构的转录因子，对胸腺的发育和T细胞的分化有促进作用，rs422628位点是GATA3基因上的SNP突变位点，位于内含子区域，该位点的突变能够影响GATA3的转录，从而影响其下游信号分子的表达，使T细胞的发育受到影响[13-14]。有研究表明，GATA-3在哮喘大鼠肺组织中的表达较高，通过抑制GATA-3的表达可减轻新生儿细菌性呼吸道炎症反应[15]。但是本研究发现，在小儿结核病的易感性方面，观察组rs422628位点TT、TC和CC3种基因型频率与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，显性、隐性和超显性3种遗传模型分析差异也均无统计学意义(P>0.05)，表明GATA3基因rs422628位点多态性与小儿结核病易感性的关联不强。IL-13主要是由活化的T辅助细胞、肥大细胞、嗜碱细胞等细胞分泌，有相关研究表明，IL-13与支气管哮喘、肺间质纤维化和急性肺损伤均有密切的关系[16-17]。IL-13可以阻断肿瘤坏死因子诱导的激活蛋白-1和核因子κB激活，抑制相关炎症因子的表达，降低炎症因子对细胞的损伤[18]。此外，IL-13还可以促进B细胞的增殖和分化，以及分泌免疫球蛋白[19]。rs20541位点位于IL-13基因的编码区，其突变可导致氨基酸由谷氨酰胺变为精氨酸，使IL-13基因的结构发生改变，进而影响免疫功能[20]。本研究发现，携带AA基因型的儿童属于小儿结核病的易感人群，隐性模型的OR值为3.349(P=0.008)，提示该类儿童患病风险较高，且携带AA基因型儿童抵抗结核分枝杆菌病原入侵的免疫力较差。本研究进一步分析了rs422628与rs20541位点联合作用与小儿结核病患病的关系，结果显示，虽然rs422628位点单独分析时与小儿结核病的易感性并无关联，但是若rs422628位点纯合突变型CC基因型与rs20541位点AA基因型同时存在，其OR值高达28.500(P=0.043)，表明GATA3基因rs422628位点纯合型突变能够在易感性方面起到辅助的促进作用，间接影响机体对结核分枝杆菌的抵抗能力。目前常见成人结核病易感人群血液IL-13水平升高的报道，鉴于IL-13基因与结核病有较高的易感性关系，本研究进一步分析了血清IL-13水平与IL-13基因rs20541位点各基因型的关系，结果显示，观察组携带AA基因型的患儿血清IL-13水平高于携带AG和GG基因型患儿，进一步证实IL-13基因rs20541位点AA基因型患儿的炎症反应程度更高。

综上所述，携带IL-13基因rs20541位点AA基因型的儿童对小儿结核病的易感性较高，患病风险较大。但是，SNP位点可能因为人种和样本量的不同存在结果差异和多样化。因此，如果可以获得更大样本量和不同民族、种族的细致划分，会使研究结果更有说服力。