组蛋白去乙酰基化酶及其抑制剂在卵巢癌中的应用*

江兰兰 综述 ，高 军 审校

(1.南昌大学第三附属医院妇产科，南昌 330006；2.南昌大学江西医学院研究生部，南昌 330006；3.江西省南昌市妇科肿瘤精准治疗重点实验室 330006)

卵巢癌是妇科最常见恶性肿瘤之一，死亡率最高，全世界每年有近18.5万人死于卵巢癌[1]。因早期缺乏特异性筛查手段，导致最初诊断已是癌症晚期。其是一种异质性肿瘤，包括超过15种肿瘤类型和基于组织学特征的亚型，2/3的卵巢癌患者被诊断为高级别浆液性肿瘤[2]。卵巢癌的常规治疗为肿瘤细胞减灭术，以及以铂类为基础的辅助化疗为主。尽管近几十年来卵巢癌患者存活率有所提高，但仍有2/3的患者在确诊后10年内死亡。在被诊断为晚期侵袭性上皮性卵巢癌的妇女中5年生存率低于20%[3]。所以，有关卵巢癌的研究一直备受关注。

过去的研究发现，表观遗传异常可能是癌症的标志之一，已被大家所知悉。如组蛋白的翻译后修饰可能通过调节基因转录、染色质重塑和核结构在癌症的发生和发展中发挥关键作用。组蛋白乙酰化是一种被广泛研究的翻译后组蛋白修饰，由组蛋白乙酰化转移酶和组蛋白去乙酰基化酶(histone deacetylases，HDAC)的相反活性控制。通过去除乙酰基逆转染色质乙酰化，可改变癌基因和抑癌基因的转录。此外，HDAC还参与了包括癌症发生和发展在内的广泛的生物学过程。现将HDAC及HDAC抑制剂(histone deacetylase inhibitors，HDACI)在卵巢癌中的应用综述如下。

1 HDAC与卵巢癌的发生和发展

HDAC基于与酵母的序列同源性可分为4类，分别为Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ、Ⅳ类。Ⅰ类HDAC主要包括HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8等；Ⅱ类HDAC进一步分为2个亚类，Ⅱa类(HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9)和Ⅱb类(HDAC6、HDAC10)；Ⅲ类HDAC主要有SIRT1～7；Ⅳ类HDAC只包含HDAC11。

Ⅰ类HDAC表达于全身组织和器官中，主要位于细胞核，其过度表达与卵巢癌的发生和发展密切相关。在恶性卵巢肿瘤、交界性卵巢肿瘤、良性卵巢肿瘤中HDAC1的阳性表达率分别为90%、60%、20%，而HDAC1在正常卵巢组织中不表达；在卵巢恶性肿瘤组中HDAC1的表达与分化程度呈负相关(r=-0.53,P=0.01)，且在低分化组中的表达显著高于中、高分化组，差异均有统计学意义(P<0.05)；但与患者年龄、术前血清癌抗原125水平、临床分期和病理类型无关[4]。使用针对HDAC1、HDAC2、HDAC3的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)对特定亚型HDAC卵巢癌细胞株SKOV3、OVCAR3、IGROV-1、ES-2、TOV112D、A2780、A2780/CDDP的影响分析表明，HDAC1的敲除显著降低了卵巢癌细胞的增殖，而HDAC3的敲除则减少了细胞的迁移[5]。有研究发现，siRNA沉默卵巢癌SKOV3细胞HDAC1，转染HDAC1 siRNA的SKOV3细胞HDAC1 mRNA和蛋白水平均明显降低，说明体外构建的HDAC1 siRNA能有效下调SKOV3细胞HDAC1基因的表达；HDAC1基因表达下调后SKOV3细胞迁移能力和侵袭能力均显著降低[6]。微小RNA-34a(miR-34a)可通过直接结合和下调HDAC1表达对卵巢癌细胞表现出抑制作用，随后降低了对顺铂的耐药性并抑制了卵巢癌细胞的增殖[7]。同样，有研究发现，在顺铂耐药的A2780CDDP细胞、A2780CDDP卵巢癌异种移植物的小鼠中，通过下调癌基因c-Myc和上调miR-34a，siRNA下调HDAC1基因可抑制细胞增殖，增加细胞凋亡和化疗敏感性；用siRNA沉默HDAC1使c-Myc表达减少，miR-34a表达增加，并使A2780细胞对顺铂诱导的细胞凋亡敏感[8]。DU等[9]发现，泛素特异性蛋白酶5(ubiquitin specific peptidase 5，USP5)可能通过抑制HDAC2的泛素化而上调其蛋白水平，下调p27的表达，从而导致卵巢癌的进展。miR-455-3p在多种肿瘤中低表达，作为抑癌基因参与调控各种生物进程,其靶向HDAC2具有诱导卵巢癌细胞HO-8910凋亡，抑制细胞增殖、侵袭和迁移，降低运动能力等作用[10-11]。

Ⅱ类HDAC分为2个亚类，近年来，与Ⅰ类HDAC比较，Ⅱ类HDAC在卵巢癌方面的研究相对较少。有研究表明，miR-370-3p通过靶向下调HDAC4抑制卵巢癌细胞的生长，并改变卵巢癌细胞的代谢[12]。HDAC4和缺氧诱导因子1-α(hypoxia inducible factor-1-α，HIF1-α)的过表达和胞浆转位均可促进自噬和抗凋亡过程，并介导p53和鼠类肉瘤病毒癌基因(rat sarcoma viral oncogene，RAS)突变体通过、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl2)、自噬相关蛋白3(Autophagy Related 3，ATG3)、自噬相关蛋白12(Autophagy Related 12，ATG12)的失调不同地控制细胞的凋亡和自噬，从而抑制或促进化疗耐药[13]。有学者发现，HDAC6使AT富集作用在1号染色体(AT-Rich Interaction Domain 1A，ARID1A)突变的卵巢癌细胞上调，然后直接去乙酰化翻译后修饰促进凋亡的p53K120Ac，而p53K120Ac是HDAC6的底物，表明ARID1A突变在功能上使p53失活，从而抑制癌细胞凋亡[14]。有研究进行的单变量分析HDAC6染色强度与总生存期(overall survival，OS)的Kaplan-Meier生存曲线结果显示，低HDAC6水平与较差的OS显著相关，差异有统计学意义[危害比(hazard ratio，HR)=0.38，95%可信区间(95%confidence interval，95%CI)：0.16～0.88，P=0.02]；调整分期、分级和细胞减少术/细胞减少术的多变量Cox回归模型分析结果显示，低HDAC6水平与OS仍显著相关，差异有统计学意义(HR降低0.19%，95%CI：0.06～0.549，P=0.002)。此外，低表达HDAC6肿瘤患者与高表达HDAC6肿瘤患者比较，HDAC6 mRNA水平OS也显著相关，差异有统计学意义(合并HR=0.88，95%CI：0.78～0.99；P=0.04)，表明低HDAC6 mRNA表达与降低生存风险有关[15]。然而对 HDAC10在癌症治疗中所扮演的角色，有研究发现，HDAC10在卵巢癌细胞中呈低表达，甚至无表达；抑制HDAC10的表达及HDAC10缺失均可提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性[16]。

Ⅲ类HDAC主要包含SIRT1-7，在这7个去乙酰化酶中，SIRT1是人类癌症中研究最多的，在许多恶性肿瘤中均扮演着双重角色，包括卵巢癌。ZENG等[17]利用数据库及相关统计学方法分析了Sirtuins家族在卵巢癌患者中的转录表达和预后意义，结果显示：(1)采用基因表达谱交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)检测卵巢癌组织和健康卵巢组织中SIRT mRNA相对水平发现，与健康卵巢组织比较，卵巢癌组织中SIRT1、SIRT2、SIRT3 mRNA水平显著降低，SIRT1、SIRT3 mRNA水平与文献报道的蛋白水平相符。其他SIRT在卵巢癌和健康卵巢组织mRNA、蛋白表达均没有差异。此外，其还研究了SIRT在卵巢癌不同阶段的表达情况，结果显示，SIRT1、SIRT5 mRNA水平在不同肿瘤分期中有显著变化，而其余的SIRT表达无差异。(2)采用Kaplan-Meier绘图仪评估SIRT水平在所有卵巢癌患者中的预后作用发现，高SIRT3、SIRT5、SIRT6、SIRT7 mRNA水平与良好的OS显著相关，而高SIRT1、SIRT4水平与较差的OS相关。此外，SIRT2、SIRT6、SIRT7 mRNA水平升高或SIRT1、SIRT4、SIRT5水平降低均与良好的无进展生存期(PFS)相关。上皮向间充质转化极大地促进了癌细胞的扩散，其特征是上皮标志物的丢失和间质标志物的获得，从而使细胞更具迁移性和侵袭性。有研究发现，SIRT1可调节卵巢癌细胞上皮标志物基因——CLDN5的转录，Kruppel样因子4(Kruppel-like factor 4 ，KLF4)是一种已知的CLDN5转录激活因子，SIRT1的脱乙酰基促进了KLF4的核积累，并增强了KLF4与细胞核内CLDN5启动子的结合，从而促进了卵巢癌细胞的侵袭和迁移[18]。相反SIRT1又可通过抑制卵巢癌上皮-间充质转化而抑制细胞迁移和侵袭，以及miR-506-3p通过靶向SIRT1/蛋白激酶B /叉形头转录因子O3a(Forkhead box O3a，FOXO3a )信号传导途径抑制卵巢癌细胞的增殖及促进凋亡[19-20]。

Ⅳ类HDAC仅包含HDAC11一种。HDAC11主要在平滑肌、心脏、肾脏和脑组织中表达,而在其他组织表达水平不高[21]。ZHOU等[22]利用Kaplan-Meier绘图仪综合研究了卵巢癌患者11种HDAC亚型mRNA表达的评估预后的价值发现，HDAC3、HDAC6、HDAC9 mRNA表达与卵巢癌患者OS、PFS无关。此外，HDAC7、HDAC8、HDAC10 mRNA高表达与卵巢癌患者良好OS和不良PFS显著相关。而HDAC1、HDAC2、HDAC4、HDAC5、HDAC11 mRNA表达与卵巢癌患者不良OS和PFS相关。值得注意的是，其中HDAC11在浆液性/Ⅲ期+Ⅳ期/Ⅲ级/TP53突变卵巢癌患者中均显示出不良OS和PFS。一项来自150例Ⅲ、Ⅳ期卵巢上皮癌患者(不包括透明细胞癌和黏液细胞癌患者及细胞减少术后接受化疗者)的样本及癌症基因组图谱描述的311例高级别晚期系列肿瘤样本的数据显示，HDAC11启动子区甲基化与卵巢癌患者的不良预后相关[23]。

2 HDACIs在卵巢癌中的应用

HDAC使组蛋白去乙酰化，染色质卷缩，抑制转录，沉默抑癌基因，抑制细胞内多种信号通路、凋亡相关基因及细胞黏附转移相关基因表达，促进肿瘤发生、发展和转移。HDACIs抑制HDAC活性，使染色质松弛，解除对抑癌基因转录的抑制，促进抑癌基因表达，抑制癌细胞增殖，促进凋亡。HDACIs分为4类，分别为羟肟酸类、短链脂肪酸类、环状四肽类和苯酰胺类，其中羟肟酸类是目前被研究最多的一类。

2.1 异羟肟酸类

异羟肟酸类HDACI是近年来研究较为广泛的一类HDACI，其组成主要包括环、脂肪链和羟肟酸，分别为表面识别区、连接区和金属结合区(锌结合区)，主要有Panobinostat、SAHA、曲古抑菌素、Belinostat等。Panobinostat能选择性地抑制癌细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ类HDAC活性，对癌细胞具有较高选择性。有研究表明，Panobinostat能抑制卵巢癌细胞增殖并诱导G2/M细胞周期阻滞、凋亡和自噬；Panobinostat与避免自噬机制的自噬抑制剂——氯喹联合应用对4株卵巢癌细胞(IGROV-1、OVCAR-8、SKOV3、A2780)的体外作用时，具有很强的协同作用，氯喹增加了导致DNA双链断裂(DSB)的活性氧物种，而Panobinostat通过避免同源修复重组酶51(RADiation sensitive 51，RAD51)正确地募集到DSB而抑制其修复，从而抑制卵巢癌细胞增殖，诱导细胞凋亡[24]。BANDOLIK等[25]在探索HDACi在高级别浆液性卵巢癌中提高铂效力的潜力时分别用顺铂、Entinostat、Panobinostat、nexturastat A联合作用于4株对顺铂敏感性不同的高级别浆液性卵巢癌细胞(CAOV3、HEY、Kuramochi、OVSAHO)及A2780细胞，结果显示，单独使用顺铂治疗组A2780细胞的半数抑制浓度(IC50)为11.0 nmol，CAOV3细胞的IC50为1.44 nmol，HEY细胞的IC50为5.25 nmol，Kuramochi细胞的IC50为4.68 nmol，OVSAHO细胞的IC50为4.83 nmol；Panobinostat联合顺铂治疗组A2780细胞的IC50为2.58 nmol，CAOV3细胞的IC50为0.74 nmol，HEY细胞的IC50为2.75 nmol，Kuramochi细胞的IC50为5.14 nmol，OVSAHO细胞的IC50为3.01 nmol。表示Panobinostat能显著提高4株高级别浆液性卵巢癌细胞中的2株(HEY、OVSAHO)和A2780细胞对顺铂的敏感性。

2.2 短链脂肪酸类

短链脂肪酸类HDACI结构比较简单，其金属结合区是其羧酸基团，主要有丁酸钠、丙戊酸(valproic acid，VPA)、苯丁酸等。VPA是临床治疗癫痫发作的常用药物，可通过调节控制基因表达的非编码RNA发挥其作用。有学者研究了VPA处理对卵巢癌细胞H19表达的影响，以及H19水平与细胞凋亡和顺铂耐药性的关系，结果显示，VPA能下调H19表达，促进A2780细胞凋亡率的增加和提高A2780/CP细胞的顺铂敏感性[26]。在临床前联合用药研究方面，多聚ADP核糖多聚酶(Poly ADP ribose polymerase，PARP)抑制剂——Niraparib可通过ATM-AMPK-ULK1途径杀死卵巢细胞，导致mTOR失活和自噬小体的形成，还可激活CD95-FADD-caspase8通路，共同导致肿瘤细胞死亡[27]。而这些信号通路可被Beclin1、ATG5、CD95、FADD或AIF下调或c-flip-s、bcl-xl过表达及下调的caspase 9所抑制。VPA与Niraparib联合作用于卵巢癌细胞时VPA能显著增强Niraparib提高自噬小体水平的能力，还能增强胞浆ATM的激活。另外Niraparib可使CD95激活增加约50%，而联合用药可使CD95激活延长约400%。MRKVICOVA等[28]在研究丁酸钠对顺铂敏感和顺铂耐药卵巢癌细胞株A2780/A2780cis的抗癌作用时发现，顺铂处理组明显抑制A2780、A2780cis细胞的增殖/活力，IC50分别为12.3、28.8 μmol/L，而丁酸钠与顺铂联合作用时细胞增殖/存活率显著降低，IC50分别为0.7、11.8 μmol/L。在A2780、A2780cis细胞周期方面，丁酸钠可抑制A2780细胞周期由G1期向S期转变，使A2780cis细胞G1期细胞百分率增加和S期细胞百分率下降，顺铂可使A2780、A2780cis细胞阻滞于G2期。当顺铂联合丁酸钠作用时丁酸钠能消除顺铂诱导的G2期阻滞，并能使A2780、A2780cis细胞大量聚集在S期。

2.3 环状四肽类

环状四肽类HDACI根据官能团分为两类，一类含(S)2-氨基-9、10-环氧-8-氧代癸酸[(2S，9S)-2-amino-9，10-epoxy-8-oxodecanoic acid，Aoe]和环氧酮；另一类不含Aoe结构，主要有Apicidin、FK228、Trapoxin等。在卵巢癌中Apicidin、FK228的研究较多。Apicidin是从镰刀菌中分离的一种环状四肽，其癸酸侧链、大环结构和色氨酸侧链竞争性结合HDAC。AHN等[29]发现，Apicidin通过下调基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2，MMP-2)表达抑制HDAC4与RECK启动子Sp1结合元件的结合，抑制卵巢SKOV3细胞迁移。FK228具有环状脱肽结构，但其主要作用机制是还原产生“弹头”硫醇基团的特征二硫键,硫醇与HDAC蛋白催化中心的锌结合,抑制酶活性。WILSON等[30]发现,FK228联合顺铂作用时能增强顺铂对SKOV3细胞的毒性作用。当FK228与顺铂联合作用时与对照组和单独使用每种药物比较，DNA损伤标志物——pH2AX的表达更高，免疫荧光检测到的全核病灶和 pH2AX 饱和染色的病灶数量及水平也显著上调。另外体内试验表明，FK228、顺铂和联合治疗减少了小鼠的肿瘤体积，联合治疗小鼠的肿瘤生长速度最慢。随后对提取的肿瘤进行IF染色，FK228与顺铂联合将pH2AX弥漫性核染色从 8.53%提高至 26.19%。另有研究发现，ZEB1的表达被FK228抑制，而ZEB1的抑制增加了间充质卵巢透明细胞癌细胞中Bcl-2相关卵巢死亡基因的表达，进而克服ABT-263的抗凋亡作用[31]。

2.4 苯酰胺类

苯酰胺类HDACI的研究没有前3种HDAC抑制剂广泛，其主要包括MS-275(Entinostat)和 MGCD0103(Mocetinostat)。在卵巢癌中Entinostat的研究较多。有研究发现，在高级别浆液性卵巢癌细胞中，Panobinostat虽能显著提高高级别浆液性卵巢癌细胞HEY、OVSAHO，但在增加顺铂敏感性方面不如Entinostat有效，Panobinostat治疗HEY、OVSAHO的IC50分别为2.75、3.01 nmol，Entinostat治疗HEY、OVSAHO的IC50分别为1.39、1.02 nmol[25]。GUPTA等[32]发现,Entinostat通过降低 BRCA1 表达和阻止复制叉进展抑制同源重组(Homologous recombination，HR)修复，增强olaparib诱导的不可修复的 DNA 损伤和最终的卵巢癌细胞死亡；Entinostat、olaparib联合作用减少了SKOV3异种移植模型中的腹膜转移，并延长了细胞周期调节蛋白E1(Cyclin E1，CCNE1)扩增HR敏感的异种移植瘤模型中的存活率。一项动物实验发现，与对照组比较，Entinostat治疗组异植瘤小鼠肿瘤重量和出现腹水概率均显著降低，OS显著延长(分别为74、62 d)，差异有统计学意义(P=0.005)。表明在免疫功能正常的小鼠中Entinostat治疗能显著减小卵巢肿瘤大小，延长生存期[33]。

3 小结与展望

卵巢癌的研究一直为妇科肿瘤领域的热点之一，因其缺乏特定的早期筛查指标，导致其发现通常已是晚期。其标准治疗是细胞减瘤术联合术后化疗，但化疗产生的耐药性，导致其复发率高、病死率高。HDAC的出现为卵巢癌的治疗提供了一线希望。

近年来，已有许多研究验证了卵巢癌的发生和发展与HDAC的过度表达有关，其通过可逆地调节组蛋白和非组蛋白的乙酰化状态，在卵巢癌的发生和发展中起着关键作用。随着研究的深入，发现敲除HDAC基因可诱导癌细胞周期停滞和凋亡，从而提供了一个关键的、有吸引力的抗癌靶点——HDACI。HDACI不仅能抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭及转移，还能与顺铂、PARP抑制剂联用，增强顺铂的敏感性和PARP抑制剂诱导的不可逆的DNA 损伤。目前，越来越多的研究表明，联合治疗可能是提高HDACI疗效的另一个重要方向，深入研究HDAC与HDACI的作用机制，将会为HDACI在肿瘤中的应用提供光明的前景。