冷冻胚胎移植中替代周期致妊娠期高血压的风险增加及可能机制研究进展*

罗星雨 综述，胥 琴，转 黎，马艳萍△ 审校

(1.昆明理工大学附属医院生殖医学科 650093；2.云南省第一人民医院生殖医学科 650032)

人类首次成功的试管婴儿是通过新鲜胚胎移植实现的。随后在试管婴儿实验室中实施了冷冻保存技术，储存由于各种原因而没有选择进行新鲜移植或冷冻保存的多余胚胎。近年来，由于多种因素，尤其是玻璃化技术作为一种冷冻技术的引入，促进了全世界胚胎冷冻保存的发展，冷冻胚胎移植(frozen- thawed embryo transfer，FET)的周期数较前显著上升[1-2]。FET的子宫内膜准备方法中替代周期较自然周期因时间上可控和周期的低取消率[优势比=0.60,95%可信区间(95%confidence interval，95%CI：0.44～0.82)而被临床广泛应用[3]。因此，必须重视使用替代周期患者导致发生妊娠期高血压疾病(hypertensive disorders of pregnancy，HDP)风险升高的问题。最近有研究表明，在替代周期FET中发生HDP的风险增加[4-6]，可能机制与黄体(corpus luteum，CL)缺失和子宫内膜处于非生理激素环境有关[7]。其中松弛素、雌二醇、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)均参与了HDP发生机制的调控，通过对孕妇心血管系统的调节和胎盘形成的调控而发挥作用。因此,探讨FET的子宫内膜准备方法变得更加重要，并具有重要意义，目前，不仅关注于哪种方法将得到更高的妊娠率，更关注于哪种方法能获得最佳的妊娠率和最好的新生儿及孕产妇结局。现将根据FET子宫内膜制备的不同方法的现有数据评估子宫内膜准备方法与HDP高风险的相关性及其可能机制综述如下。

1 FET子宫内膜准备方法

FET前子宫内膜准备方法有自然周期、改良自然周期和激素替代周期。自然周期指具有正常卵巢功能且能正常排卵者，不需用大剂量外源性雌、孕激素刺激子宫内膜，只需精确监测患者排卵时间，并在排卵后合适的时间进行FET。改良自然周期指在自然周期基础上加用氯米芬、来曲唑诱导排卵或加用促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素帮助卵泡生长或破卵。在自然周期和改良自然周期中往往会有一个甚至多个CL形成。替代周期指在月经第3～5天给予大剂量雌激素促进子宫内膜生长及抑制卵泡生长，当监测到子宫内膜厚度大于7 mm时给予孕激素转化内膜再按合适时间进行FET。替代周期中没有排卵，故无CL形成。

2 HDP的定义和发生机制

美国妇产科医师大会妊娠高血压特别工作组于1972年引入了先兆子痫的分类，并于2013年更新了该分类,目前，HDP定义为妊娠与血压升高并存的一组疾病，分为4类，即HDP、子痫前期-子痫、慢性高血压并发子痫前期和妊娠合并慢性高血压[8-10]。HDP的发生机制主要为胎盘缺陷、胎盘缺血、螺旋动脉重塑异常、母胎界面氧化应激、母体循环中血管生成不平衡及随后的内皮和最终器官损伤[8，11]。

3 替代周期导致发生HDP的风险升高

3.1 FET较新鲜胚胎移植具有更高的HDP发生率

2016年，荷兰研究团队实施了一项前瞻性随机对照试验，纳入1 032例患者，结果显示，替代周期组患者发生HDP的概率较自然周期组高，差异有统计学意义(相对风险为0.27，95%CI：0.08～0.94，P=0.031)[12-13]。2016年，CHEN等[14]比较了1 508例多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)的不孕妇女，均在进行第一次试管婴儿周期，将患者分为新鲜胚胎移植组和FET组，结果显示，FET组妇女先兆子痫发生率(4.4%)明显高于新鲜胚胎移植组(1.4%)，差异有统计学意义(95%CI：1.26～7.73，P=0.009)。虽然该研究并未关注FET中的自然周期和替代周期后发生HDP的风险问题，但该研究纳入的群体均为PCOS患者，而PCOS患者大多数无法正常排卵，因此，在施行FET行子宫内膜准备的过程中绝大多数需实施替代周期。而新鲜胚胎移植类似改良自然周期。提示实行替代周期患者较改良自然周期患者可能具有较高的发生HDP的风险。但由于比较的是新鲜胚胎移植和FET，因此，无法判断最后发生HDP的风险不一致是因为子宫内膜的准备方法不同，还是因为胚胎被冷冻后发生的改变所致。

3.2 HDP发生率与胚胎冷冻保存无关

为了解胚胎低温保存是否与发生先兆子痫的风险有关，2017年，SITES等[15]开展了一项回顾性研究，纳入15 937例患者，比较了FET与新鲜胚胎移植发生先兆子痫的概率，结果显示，在自体卵导致单胎妊娠的情况下FET与新鲜胚胎移植比较，先兆子痫发生率更高(分别为7.51%、4.29%)，差异有统计学意义(调整后优势比为2.17，95%CI：1.67～2.82，P=0.000 1)。然而那些采用供体卵进行试管婴儿的患者，FET与新鲜胚胎移植后发生先兆子痫发生率比较，差异无统计学意义(P>0.05)[15]。该研究验证了胚胎保存方法与先兆子痫的发生无关，提示发生先兆子痫风险的相关性因素可能是子宫内膜准备方法的不同。

3.3 替代周期较自然周期具有更高的HDP发生率

SAITO等[16]开展了一项大样本回顾性队列研究，比较了自然周期FET(29 760例)和激素替代周期FET(75 474例)患者的妊娠结局，多元logistic回归模型分析结果显示，激素替代周期FET组患者发生HDP的概率增加(调整后优势比为1.43，95%CI：1.14～1.80)。2019年，GINTRÖM等[6]设计了一项研究，将FET患者分为自然周期组(6 297例)、改良自然周期组(1 983例)和激素替代周期组(1 446例)，结果显示，激素替代组与HDP高风险相关(调整后优势比为1.78、1.61，95%CI：1.43～2.21、1.22～2.10)；另外，该研究纳入了PCOS患者，其中自然周期组PCOS患者占11.9%，改良自然周期组PCOS患者占15.3%，激素替代周期组PCOS患者占34.1%。PCOS患者不能正常排卵，更多的选择替代周期，故激素替代周期患者中PCOS患者较另外两组多，由于未进行归因性分析，故无法排除发生HDP的高风险与PCOS疾病本身有关。同年VON VERSEN-HÖYNCK等[5]进行的一项研究纳入683例患者，按CL数量分为改良自然周期组(CL≥1)和替代周期组(CL=0)。与改良自然周期组比较，替代周期组患者先兆子痫发病率较高(分别为12.8%、3.9%)，差异有统计学意义(P=0.02)。WANG等[17]进行的一项研究的logistic回归模型分析结果显示，在替代周期中，先兆子痫发生率明显高于自然周期(相对风险为2.55，95%CI：2.06～3.16)，推测与CL功能不足有关，考虑替代周期是先兆子痫的独立危险因素。ZHANG等[18]设计了一项研究，首次均选用PCOS患者(2 427例)分析了改良自然周期和替代周期后FET患者发生HDP的差异，结果显示，在单胎妊娠中，改良自然周期组患者比替代周期组发生HDP的风险低(调整后优势比为0.63,95%CI：0.40～0.98)，双胎妊娠中改良自然周期发生HDP的风险也较低(调整后优势比为0.52,95%CI：0.30～0.87)。该研究均为PCOS患者，可排除HDP的高风险是PCOS疾病本身所致，故考虑FET前的子宫内膜准备方法才是发生HDP风险不同的主要因素。支持替代周期是孕妇发生HDP的危险因素这一结论。

4 替代周期致HDP风险增加的可能机制

4.1 松弛素缺乏

替代周期与自然周期的区别是前者无排卵，故无CL形成，而自然周期有一个或多个CL。CL在妊娠期间，尤其是妊娠前3个月发挥了极其重要的作用。妊娠早期CL主要分泌雌激素、孕激素、松弛素、VEGF等。在替代周期中会外源性补充雌、孕激素，但并未补充松弛素及其相关因子。VON VERSEN-HÖYNCK 等[19]根据CL数量将患者分为CL=0组，CL=1组，CL>3组，结果显示，CL=0组与CL=1组比较，前者血清松弛素水平明显降低(分别为213.0、517.0 pg/mL)，差异有统计学意义(95%CI：12.0～15.5、293.6～625.2，P=0.001)。与自然周期FET比较，在替代周期中松弛素水平也较低(分别为13.0、489.7 pg/mL)，差异有统计学意义(95%CI：12.0～15.5、251.5～864.2，P=0.001)，但自然周期FET与自然受孕(分别为489.7、517.0 pg/mL，)比较，差异无统计学意义(95%CI：251.5～864.2、293.6～607.1，P=0.98)。CL缺失导致松弛素缺乏，而松弛素主要具有血管舒张的作用[20-22]，可能是其导致替代周期组患者发生先兆子痫风险较高的主要原因。DEBRAH等[23]给未怀孕雌性大鼠服用松弛素发现，未怀孕服用松弛素大鼠出现与正常大鼠怀孕期间观察到的相似全身血流动力学和动脉机械特性改变。该研究通过用抗体中和循环松弛素证明松弛素的参与增加了妊娠中期大鼠总体动脉的顺应性，参与了总心输出量的调控，并降低了全身血管外周阻力，证明松弛素参与了妊娠心血管适应的调控。另一项研究也证明，在没有CL的情况下FET子痫前期发病率增加，并且中枢动脉顺应性的妊娠增加受损[5]。此外，松弛素缺乏也可导致孕妇肾脏功能受损，血浆渗透压改变，从而导致子痫前期高风险。SMITH等[24]通过对卵巢功能正常妇女(9例)和接受赠卵妇女(无循环松弛素，9例)在妊娠前3个月24 h估计肌酐清除率(CrCl)和血浆渗透压对肾脏功能进行一系列测量，结果显示，所有妊娠均与CrCl升高和血浆渗透压降低有关，但卵巢功能正常女性血浆渗透压降低幅度更大，且CrCl升高更明显，差异均有统计学意义(P=0.017、0.005)。证明松弛素在人类妊娠中可引发肾血流动力学增强和血浆渗透降低，而这些改变又可导致HDP发病风险升高。MARSHALL等[25]进行的一项研究表明，松弛素通过减少肌源性张力和增加血流介导血管舒张，在介导怀孕期间正常母体肾血管适应中具有重要作用。VON VERSEN-HÖYNCK等[26]发现，实行替代周期缺乏CL且循环血清松弛素无法检测患者与存在松弛素患者比较，血清肌酐、钠、二氧化碳总量均明显更高，差异均有统计学意义(P=0.001、0.011、0.001)。提示在没有CL的情况下孕妇肾功能及渗透调节功能受到损害，可能导致发生HDP的风险更高。

4.2 内皮祖细胞受损

目前有研究发现，HDP的发生与内皮祖细胞损伤有关，子痫前期患者脐血促血管生成循环祖细胞和内皮集落形成细胞减少[27-29]。VON VERSEN-HÖYNCK等[19]将患者分为替代周期组FET和自然周期组FET，统计妊娠早期患者血管生成和非血管生成的循环祖细胞数量，结果显示，替代周期组患者血管生成和非血管生成的循环内皮祖细胞数量均降低，差异均有统计学意义(P=0.01、0.03)。表明CL缺失可能参与了子痫前期的发生。

4.3 非生理剂量雌二醇与HDP的相关性

在替代周期中会外源性补充雌二醇，且补充的雌激素量比生理剂量大很多。一项为探究雌二醇与子宫螺旋动脉重塑关系的研究应用灵长类动物狒狒作为研究对象，一组不给予特殊治疗，另两组在妊娠第25～<60 d用雌二醇或雄烯二酮处理，评估3组狒狒妊娠第60天(足月为184 d)滋养细胞侵袭螺旋动脉水平,结果显示,与未经处理狒狒比较，雌二醇或雄烯二酮组狒狒血清雌二醇水平增加3倍，差异有统计学意义(P=0.01)，测量雌二醇组、雄烯二酮组和未经处理狒狒被绒毛外细胞滋养层细胞侵入的子宫螺旋动脉直径分别为26～50 μm、51～100 μm、>100 μm，较药物处理前下降百分比分别为100%、90%、75%，差异有统计学意义(P=0.001)。证明在狒狒怀孕早期低水平雌激素能使滋养层血管浸润正常进展，并可使绒毛外滋养层细胞迁移至具有子宫重塑功能的子宫螺旋动脉中，怀孕后期雌二醇水平升高会阻止进一步的重塑[30]。如雌二醇过早升高，绒毛滋养细胞对螺旋动脉的侵袭就会受到抑制[31]。螺旋动脉重塑出现异常将导致胎盘灌注不足及局部缺血，并且似乎与子痫前期严重程度相关[8，11,32]。

4.4 VEGF的作用

CL还产生其他血管活性物质，如VEGF，而在FET替代周期中，VEGF并未被外源性替代[33]。一项研究设计了从健康孕妇和患有子痫前期孕妇的外周血中通过流式细胞术计数表达CD34或CD133与VEGF受体2(VEGFR-2)结合的细胞，结果显示，在正常妊娠期母体循环中CD34+VEGFR-2+和CD133+VEGFR-2+祖细胞均增加，但子痫前期患者相对减少[分别为0.00(0.00，0.19)、0.00 (0.00，0.18)],差异均有统计学意义(P=0.01、0.03)[34]。有研究表明，在大鼠、小鼠和人类中存在松弛素舒张血管机制的一致性，并且VEGF是松弛素舒张血管机制中必不可少的中间参与者[35]。当CL缺失、VEGF缺乏时松弛素舒张血管的作用也会受到影响，VEGF减少可导致患者心血管适应降低，发生HDP的风险升高。

综上所述，大量研究表明，使用替代周期患者发生HDP的风险较高。可能机制十分复杂，本文主要从CL缺失、松弛素缺乏、内皮祖细胞受损，以及非生理剂量雌二醇的应用、VEGF的参与等方面进行了叙述。松弛素在孕妇孕早期心血管适应方面发挥着极其重要的作用，当CL缺失时分泌的松弛素缺乏，从而导致发生HDP的风险增加；此外，在替代周期中，非生理剂量性激素的应用会导致子宫螺旋动脉重塑异常，增加HDP发病风险；VEGF是松弛素发挥舒张血管作用机制中的重要中间参与者，VEGF缺乏会导致患者血管适应性降低，增加HDP发病风险。但目前关于使用替代周期患者发生HDP风险上升的具体机制并未完全明确，特别是参与的具体信号通路，以及参与的具体细胞因子等仍有待于进一步研究，以明确替代周期导致发生HDP风险升高的具体原因，为临床防治寻找靶点。由于替代周期会导致HDP发病风险上升，是否可应用改良自然周期代替替代周期仍有待于进一步的临床验证。大量研究表明，松弛素在孕期，尤其是孕早期发挥了不可取代的作用。那么，在使用替代周期患者中外源性补充生理剂量松弛素是否可让患者获益、松弛素的应用能否改善替代周期导致的HDP发病风险的上升，仍有待于进一步研究明确。