RHO/ROCK信号通路抑制剂在奥沙利铂化疗施旺细胞损伤中的保护作用研究

李 娜，姚 娜，田 稼

目前化疗已成为肿瘤治疗的一种重要方法，化疗不良反应众多，末梢神经炎是其中较为常见的一种，被称为化疗所致的周围神经病变(CIPN)。报道指出,约90%癌症患者在化疗期间发生CIPN,30%患者在化疗结束后仍出现永久性的神经损伤[1]。但到目前为止，还没有特定的药物能够预防CIPN。施旺细胞(SCs)是周围神经系统中一种神经胶质细胞，围绕周围神经轴突形成髓鞘，SCs可分泌GDNF等多种神经活性分子、为轴突提供支持、改善神经细胞微环境，对维持神经纤维的存活、生长及神经损伤修复发挥了重要作用[2-3]。研究表明RHO/ROCK信号通路在肿瘤发生发展的各个环节都发挥着重要的作用，是肿瘤治疗的重要靶点，同时RHO/ROCK信号通路抑制剂在支气管哮喘、肥胖、糖尿病、冠心病、肾病等疾病的治疗中有潜在应用价值[4-6]。本文进一步研究探讨了RHO/ROCK信号通路抑制剂在化疗致SCs损伤中的保护作用及CIPN预防中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料：大鼠施旺细胞(BNCC341121)购自北纳生物，奥沙利铂购及RHO/ROCK信号通路抑制剂Y27632购自MCE。Bcl2 兔多克隆抗体(26593-1-AP)、BAX兔多克隆抗体(50599-2-Ig)、Caspase 3兔多克隆抗体(19677-1-AP)、TOM70 兔多克隆抗体(14528-1-AP)、OPA1 兔多克隆抗体(27733-1-AP)、DENR 兔多克隆抗体(10656-1-AP)及HRP-山羊抗兔二抗(SA00001-2)购自Proteintech 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 SCs培养:DMEM细胞培养液中加入10%FBS、1%双抗，细胞培养条件：37℃、90%湿度、5% CO2恒温培养箱，每2 d 换液1次，细胞贴壁达到80%进行传代。

1.2.2 实验分组：取对数生长期SCs，按照细胞处理方式分为：①正常对照组:正常培养细胞；②奥沙利铂处理组：SCs加入0.5 mol/mL奥沙利铂；③抑制剂组：奥沙利铂处理组细胞预先加入10 μmol/mL Y27632，处理48 h 后收集各组细胞进行检测。

1.2.3 线粒体膜电位(MMP)及细胞凋亡检测：收集3组细胞，75%无水乙醇固定30 min，PBS溶液800 g离心洗涤3次，加入配置好的细胞线粒体膜电位与细胞凋亡检测工作液，4℃避光孵育1h后流式细胞仪检测。

1.2.4 Western-Blot检测：收集各组细胞用冰冷PBS洗涤3次，然后用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解，离心收集上清，用Bradford法测定细胞蛋白含量，电泳，转膜，5%脱脂乳孵育1 h，一抗[Bcl2(1∶3 000)、BAX(1∶2 000)、Caspase 3二抗(1∶10 000)室温孵育1 h，PBST洗膜,ECL发光检测。采用ImageJ 1.46程序，通过密度(1∶2 000)、TOM70(1∶2 500)、OPA1(1∶3 000)、DRP1(1∶2 000)]4℃孵育，二抗(HRP-山羊抗兔光密度，OD)法对电泳带图像并进行相对定量分析。

2 结果

2.1 CCK83组细胞增殖状况检测：与正常对照组比较，实验组、抑制剂组24 h和48 h细胞OD值均低于正常对照组(P<0.05)；抑制剂组与实验组比较，24 h和48 h细胞OD值抑制剂组高于实验组(P<0.05)，见图1(目录后)。

2.2 3组SCs细胞凋亡检测：与正常对照组比较，实验组、抑制剂组细胞凋亡率高于正常对照组(P<0.05)；抑制剂组与实验组比较，抑制剂组细胞凋亡率低于实验组(P<0.05)。实验组、抑制剂组与对照组比较Bcl2蛋白表达下调，Bax、Caspase3蛋白表达上调；抑制剂组与实验组比较，BCL2蛋白表达上调，Bax和Caspase3蛋白表达下调，见图2(目录后)。

2.3 3组SCs细胞线粒体膜电位检测：与正常对照组比较，实验组、抑制剂组MMP高于正常对照组(P<0.05)，抑制剂组MMP低于实验组(P<0.05)，见图3(目录后)。

2.4 3组SCs细胞线粒体结构功能蛋白检测：实验组、抑制剂组与对照组比较，DRP1蛋白表达上调，OPA1、TOM70蛋白表达下调；抑制剂组与实验组比较，DRP1蛋白表达下调，OPA1、TOM70蛋白表达下调，见图4(目录后)。

3 讨论

CIPN是抗肿瘤药物的主要且常见的副作用之一，常见可引起CIPN的化疗药物有铂类(顺铂、卡铂和奥沙利铂)、微管蛋白抑制剂(紫杉醇)及蛋白酶体抑制剂(硼替佐米)[7]，尤其是铂类药物引起的CIPN,其发生率可高达81.5%～98%。有研究显示，CIPN主要表现为患者四肢对称部位的麻木、刺痛、触觉减退或异常感，严重时可出现腱反射消失、运动失调[8]，同时更容易出现残疾和跌倒[9]。然而目前尚未有明确有效的方法来防治CIPN的发生和发展[10]。

SCs是周围神经的主要神经胶质细胞，它们通过形成髓鞘来维持周围神经系统的可塑性，为神经元提供支持和营养，调节神经元微环境的平衡。神经损伤后，SCs被刺激去分化和增殖，然后迁移到损伤区清除髓鞘碎片恢复神经元的稳态。在周围神经的再生及神经损伤修复中发挥着重要作用。因此，促进SCs的增殖会加速轴突的生长和周围神经损伤后的功能恢复。

RHO激酶是一种蛋白激酶，包括肌球蛋白轻链和肌球蛋白轻链磷酸酶参与RHO/ROCK信号通路，磷酸化的下游目标，调节肌动蛋白细胞骨架组织和内皮屏障功能[11]。RHO/ROCK信号通路还参与细胞黏附、迁移、增殖、细胞因子激活、炎症细胞迁移、平滑肌细胞收缩和细胞周期调节。最近的几项研究表明，抑制RHO/ROCK通路可以产生多种作用，包括抗肿瘤[12-13]、抗炎、抗凋亡和抗氧化作用[14-15]。

BAX、Caspase3作为促凋亡蛋白，其表达升高可促进细胞凋亡。TOM70是线粒体外膜转运蛋白中的一种,在维持线粒体正常形态、结构和功能的中起着重要作用[16-18]。研究发现，TOM70缺失会损伤心肌细胞的线粒体完整性，促进ROS产生，最终加重细胞损伤[19]。OPA1是线粒体内膜的主要融合蛋白，而DRP1则参与线粒体分裂的调控，这种融合-分裂的平衡被破坏将导致线粒体片段化并出现功能性的障碍，表现为ATP合成减少，ROS产生增多等，进而促进细胞凋亡及疾病的发展[20]。

本次研究表明奥沙利铂通过上调DRP1蛋白表达，下调OPA1、TOM70蛋白表达诱导SCs线粒体结构、功能紊乱，同时通过上调Bax、Caspase3蛋白表达，下调Bcl2蛋白表达促进细胞凋亡导致SCs损伤，而RHO/RACK通路抑制剂可显著逆转上述变化，保护SCs线粒体功能及结构完整性，抑制细胞凋亡，从而起到保护作用。