唾液外泌体中口腔鳞癌相关生物标志物研究进展

张芮初, 贾凌飞

(1．北京大学口腔医学院，北京 100191； 2. 北京大学口腔医院口腔颌面外科，北京 100081)

外泌体始于质膜内陷形成的内吞囊泡，由内体膜向内出芽构成多泡体，在多泡体与质膜融合期间经胞吐作用被分泌到细胞外环境中。外泌体可由多种类型的细胞产生，广泛存在于多种体液中，例如血液、尿液、唾液、乳汁、羊水等[1]。外泌体中内容物的变化可以作为诊断及判断疾病预后的生物标志物[2]。与血液相比，唾液有易采集、不易凝结等优点，而且唾液中的大部分成分来自于血液，受身体生理和病理变化的影响，全新的无创唾液诊断正在兴起[3]。本文仅就唾液外泌体作为口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)及口腔潜在恶性疾病(oral potentially malignant disorder, OPMD)相关潜在生物标志物的研究进行综述。

1 唾液外泌体的成分与特性

唾液外泌体为平均直径30～100 nm的杯状囊性小泡，具有完整的磷脂双分子层结构，以保护和运载其中的脂质、酶、蛋白质、信使RNA(messenger RNA，mRNA)和微小RNA(micro RNA，miRNA)等[2]。

通常唾液外泌体的膜蛋白标志物有四跨膜蛋白(CD63、CD9、CD81等)、水通道蛋白(AQP5)、主要组织相容复合物Ⅰ类和Ⅱ类蛋白等；其磷脂双分子层内包含了各种细胞质蛋白，如酶、热休克蛋白、细胞骨架蛋白、内吞体分选转运复合体相关蛋白，免疫球蛋白IgA和聚合免疫球蛋白受体以及来自亲代细胞的膜融合/转运相关蛋白等[1-2]。唾液外泌体中也发现与细胞中Wnt5B/β-catenin信号通路、Delta样配体4/Notch信号通路以及泛化素通路等相关的蛋白[4]。

除蛋白质外，唾液外泌体还携带大量生物活性物质，如mRNA、miRNA以及细胞因子等。近年来，人们越来越关注miRNA作为潜在的生物标志物，用于诊断、预后和评估多种疾病的治疗效果。miRNA是小的、非编码RNA，长度约为19～23个核苷酸。miRNA通过3’UTR与mRNA结合，参与转录和翻译后的基因表达调控。miRNA参与多种细胞过程，如细胞凋亡、增殖和分化等。研究[5]发现miRNA的异常表达与越来越多的疾病状态有关，包括恶性肿瘤、炎症、神经系统退化和自身免疫性疾病等。

2 唾液外泌体的分离

2.1 传统的外泌体分离方法传统的外泌体分离方法主要有差速超速离心法、超滤法、尺寸排除色谱法、聚合物沉淀法和免疫分离法。

差速超速离心法利用外泌体在高速旋转时沉降系数不同来分离唾液外泌体。该方法产量高，操作简单，不受分离试剂的污染，是目前应用最广泛的提取外泌体的方法；其缺点是工艺复杂、操作时间长、要使用专用的设备。另外，超高速离心容易引起外泌体破裂，导致收集到的唾液外泌体量变小[6]。

超滤法使用基于不同截留相对分子质量的超细纳米膜来选择性分离样品，得到外泌体。虽然超滤速度快，不需要任何特殊设备，但附着在滤过膜上可能会对唾液外泌体膜造成损害，从而影响其生物活性[7]。尺寸排除色谱法基于凝胶孔径与样品分子相对大小的溶质分离，可以去除非外泌体结合的可溶性蛋白和其他污染物，还可将小囊泡与大囊泡分开，但是无法区分相同大小的外泌体和微泡。这种方法提取的外泌体纯度和完整性较好，但是样品产量少[8]。

聚合物沉淀法是一种最简单的外泌体分离方法。样品经低速离心预处理去除细胞碎片，然后加入聚乙二醇等聚合物与样品共孵育。该方法可以提取大量的外泌体，但非外泌体颗粒可能与产物共同分离出来，会影响制备的纯度[9]。

免疫分离法利用外泌体表达常见的靶蛋白，通过磁珠、酶联免疫吸附剂测定、流式细胞术等捕获外泌体。其中磁珠法比较常用，该方法是将磁珠涂上相应抗原(如抗CD9、抗CD63等)，孵育后与样品结合，从而吸附分离样品中相关的靶蛋白[7]。该方法提取的外泌体特异性最高，但酸性和低渗溶液不利于外泌体的形态和生物活性的维持。价格也限制了其普及。

2.2 基于微流体的分离技术为了克服以上几种传统的外泌体分离技术的缺陷，微流体利用单个芯片分离和检测外泌体，因其简单、性价比高、易于自动化、能精确处理微尺度、分析时间短、样品和试剂消耗量小而受到关注。尤其是无标记的方法在成本、时间、可重复性、减少潜在的样品污染、保持外泌体天然特性方面更具优势[10]。最近Chen等[11]提出的EXODUS超快速外泌体分离系统，在纳米多孔阳极氧化铝双膜过滤结构中引入双耦合谐波振荡，横波声控流抑制了结垢效应，避免了流速下降。实验证明EXODUS在产量、速度和纯度上优于现有的外泌体分离技术。

3 唾液外泌体中OSCC的潜在生物标志物

OSCC占口腔癌的90%以上，可发生在上下颌牙龈、舌、颊部、口底、颚部等部位，5 a生存率只有50%左右，早发现和早治疗对于患者至关重要[12]。因缺乏明显的早期症状，导致大多数OSCC病例只能在晚期被诊断出来[13]。组织活检手段并不适合日常筛查，临床上非常需要唾液外泌体生物标志物这样的成本效益高、简单、非侵入性的即时检测技术，从而更方便开展OSCC的早期诊断和预后跟踪。

3.1 唾液外泌体中的OSCC相关标记蛋白Winck等[14]首次对OSCC患者和健康个体唾液外泌体的蛋白进行了质谱分析。在检测的381个蛋白中，有8个蛋白 (A2M、HPA、MUC5B、LGALS3BP、IGHA1、PIP、PKM1/M2、GAPDH)的表达在病例组和对照组之间有显著差异，显示一些免疫反应的过程与OSCC有关，并提示对外泌体进行蛋白质组学分析有助于辅助医生对OSCC患者的早期诊断和预后判断。

Zlotogorski-Hurvitz等[15]使用透射电子显微镜和原子力显微镜发现OSCC患者唾液外泌体的数量及体积相较健康个体有所增加，通过酶联免疫吸附试验和蛋白质印迹发现OSCC患者唾液外泌体中CD63的表达升高而CD9和CD81的表达显著降低。这些结果表明，唾液外泌体的形态改变和表面标志物表达水平具有早期诊断OSCC及OSCC高危人群的潜力。

3.2 唾液外泌体中的OSCC相关标记miRNA唾液外泌体中miRNA作为OSCC生物标志物的研究开始得比较早，miR-125、miR-200a和miR-31是近些年比较受关注的几种唾液外泌体miRNA，前两者在OSCC患者的唾液中显著降低，而miR-31则在OSCC患者唾液中过度表达，这3种miRNA被广泛建议潜在用作诊断和监测OSCC的发展[2]。

Gai等[16]对来自OSCC患者和健康对照者的唾液外泌体中的miRNA进行分析发现，OSCC组织中miR-512-3p和miR-412-3p相对于对照组显著上调，具有较高的敏感度和特异性，而miR-302b-3p和miR-517b-3p仅在OSCC组织中表达，提示唾液外泌体中这4种miRNA有作为早期诊断OSCC生物标志物的可能。

He等[17]通过miRNA微阵列分析发现，与健康对照相比，OSCC患者唾液外泌体中miR-24-3p的表达显著增加，且具有较高的敏感性和特异性；此外，miR-24-3p的过表达还促进了OSCC细胞的增殖并调节了细胞周期相关基因的表达。这提示miR-24-3p有作为OSCC早期诊断指标及靶向治疗的靶点的潜力。

Mehterov等[18]通过微阵列分析发现miR-30c-5p在OSCC患者的唾液外泌体中相较健康个体显著下调，具有较高的敏感性和特异性，表明其具有作为OSCC诊断标志物的价值；研究还发现miR-30c-5p的靶基因中有31个参与p53和Wnt信号通路，并可以调控OSCC的生长、转移和放疗抗性。

3.3 OSCC的唾液外泌体光谱特征Zlotogorski-Hurvitz等[19]利用傅里叶变换红外光谱仪观察到OSCC患者唾液外泌体的核酸内磷酸键的吸收带和膜脂带强度低于健康个体，而糖原带、核酸带和amine Ⅱ膜蛋白强度高于健康个体，显示出OSCC唾液外泌体的特定红外光谱特征。这种方法区分OSCC和健康个体具有100%的敏感性和89%的特异性。这表明傅里叶变换红外光谱仪有应用于诊断早期OSCC并监测OSCC前病变的风险人群的潜力。此外，因其在早期和晚期OSCC中的结果不同，也可用于OSCC患者随访。

4 唾液外泌体与OPMD

OPMD是一种重要的癌前病变，包括口腔扁平苔藓(oral lichen planus, OLP)、口腔白斑病(oral leukoplakia, OLK)、口腔红斑病、口腔黏膜下纤维病变(oral submucous fibrosis, OSMF)等。据推测，OPMD患者罹患OSCC的风险是普通人的5～100倍[20]。考虑到OPMD的恶性倾向，OPMD患者应当定期跟踪病情的进展乃至进行终生随访。相比组织病理活检和血液检查，唾液外泌体检查的非侵入性就体现出巨大的优势。

4.1 OLP的唾液外泌体标记OLP是以T细胞介导的免疫反应异常激活的慢性炎症，表现为基底角质细胞液化变性以及淋巴细胞的带状上皮下浸润，临床上可能呈现角化、红斑和溃疡性病变等症状。目前，WHO已将其定义为癌前病变[21]。据报道，相较于健康个体，OLP患者及OSCC患者的唾液外泌体中miR-21水平升高、miR-125a水平降低，说明这2种改变可能预示着预后不良。相反，与健康个体相比，发育不良OLP和OSCC患者的miR-31和miR-200a水平显著增加，但在来自非发育不良OLP患者的样本中没有发现此现象；相较健康个体及OLP患者，仅OSCC患者的显著降低，此结果提示miR-31和miR-200a水平无显著变化可能表明病情没有恶性转化[22]。

4.2 其他OPMD中的外泌体目前关于OLK、口腔红斑病、OSMF等唾液外泌体生物标志物的独立研究比较少见，但是已经有关于OPMD唾液外泌体的复合研究。Al Rawi等[23]通过文献检索发现唾液外泌体中的miR-375具有作为OSCC等OPMD的临床诊断与预后评估生物标志物的潜在应用价值。

Uma Maheswari等[24]在一项36例OPMD患者(OLK、OLP和OSMF)参与的唾液miR-21和miR-31评估中，发现miR-21 和 miR-31 的上调在OLK和OLP中显著，在OSMF和具有OLK的OSMF中最小。OPMD严重发育不良与对照组相比，唾液miR-21增加了3.6倍，miR-31增加了2.5倍。说明miR-21与严重发育不良之间存在着明显关系，因此在评估OPMD的极早期恶性变化方面，唾液外泌体中的miR-21比miR-31的潜力更大。

最近有学者使用定量酶联免疫吸附试验研究了口腔癌前病变患者及健康个体唾液中可能来自唾液外泌体的IL-6及其mRNA的水平。Scholtz等[25]发现，与健康个体相比，在癌前病变组中检测到IL-6 mRNA水平升高，表明唾液IL-6 mRNA水平升高可能与口腔中的肿瘤转化相关。

5 结语与展望

唾液外泌体已经体现出比其他液体活检的显著优势，不仅仅体现在采样的方便、无创方面，而且相比传统唾液诊断的限制，例如污染以及淀粉酶等蛋白质的存在可能掩盖其他低表达蛋白等，外泌体的高生物稳定性、特异性和灵敏性大大增强了唾液外泌体的临床适用性。唾液外泌体中含有大量的生物分子，这些分子表达水平的变化可用于疾病的早期筛查诊断、监测临床状态、疾病进展和治疗效果。同时，外泌体具有携带生物分子的功能，有潜力发展成为临床药物传递载体。到目前为止，虽然已经发现唾液外泌体可能成为多种口腔恶性病变的生物标志物，但是这方面的研究仍然处于非常早期，还有许多空白需要突破。相信随着唾液外泌体受重视程度的提高以及技术的成熟和研究的深入，将会发现更多特异性和敏感性较高的唾液外泌体生物标志物。