胞内菌与宿主自噬的相互作用

吴移谋， 黄燕茹， 卢思敏， 王建业

(南华大学衡阳医学院病原生物学研究所，湖南省衡阳市421001)

自噬是一种保守的细胞降解途径，由自噬相关基因(autophagy-related genes，ATG)编码的蛋白介导。自噬发生时，会在错误折叠的蛋白质，功能失调的细胞器或入侵的病原体等细胞质组分周围形成双层膜结构的囊泡(自噬体)，将其包裹并转运至溶酶体进行降解。这些物质被溶酶体蛋白酶降解成氨基酸和脂肪酸等小分子物质后，被细胞循环利用，进而维持细胞稳态[1]。自噬不仅有利于细胞分解代谢，也是抵抗病原体感染的重要防御机制，自噬体捕获入侵的细菌，将其递送到溶酶体中进行降解，限制病原体在细胞内的生存与繁殖[2]。而另一方面，胞内菌也演化出了一系列逃逸宿主细胞自噬的策略。甚至一些胞内菌可调控自噬，利用自噬机制形成复制生态位，促进自身在细胞内的生长。随着细胞自噬在病原体感染过程中的研究进展，发现胞内菌与宿主细胞自噬的相互作用复杂多变。全面系统的阐明自噬发生发展的分子机制以及与胞内菌的相互作用将有助于理解胞内菌感染的免疫逃逸机制，为胞内菌感染治疗提供理论基础和有效的治疗靶点。

1 细胞自噬

1.1 细胞自噬的分类

自噬分为经典自噬与非经典自噬。其中，根据自噬底物的特点、转运类型及调控机制的不同，经典自噬可分为分子伴侣介导的自噬、微自噬和巨自噬[3]。巨自噬即通常所指的自噬(下文简称自噬)，在遗传学中定义为依赖于ATG调控，在形态学上表现为双层膜结构的自噬体在细胞质中出现且能与溶酶体融合[4]。自噬从酵母到哺乳动物体内均是高度保守的，可分为以下几个步骤：自噬信号诱导，前体物质形成，吞噬泡延伸，自噬体与溶酶体的融合以及自噬溶酶体的降解[5]。

而非经典自噬途径主要是指以胞内大分子为目标的LC3相关吞噬作用(LC3-associated phagocytosis，LAP)。细胞吞噬病原体后，将其隔离在LC3阳性的单膜隔室中，称为LAPosome。LAPosome将病原体运输至溶酶体进行降解并清除。细胞自噬水平与感染性疾病的发生发展密切相关，其中巨自噬和LAP在抗病原体感染中发挥重要作用。因此，本文主要讨论巨自噬与LAP在细胞防御中的作用[6]。

1.2 细胞自噬的发生与调控

自噬体的诱导受到一系列信号通路的严格调控，包括ATG蛋白的亚细胞定位和翻译后修饰。ULK-51样激酶1(UNC-51-like kinase 1，ULK1)复合物是自噬信号起始复合物，主要受到哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin complex 1，mTOR)和腺苷酸激活激酶(AMP-activated kinase，AMPK)两个上游因子的调节[7]。在细胞内营养充足的情况下，mTOR具有活性，通过磷酸化ULK1 Ser 757抑制自噬。当细胞内营养缺乏或病原体感染时，mTOR处于非活性状态，AMPK通过磷酸化ULK1的Ser 317和Ser 777启动自噬体形成[8]。同时，ULK复合物调节Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3，PI3KC3)复合物的磷酸化和募集，进而促进磷脂酰肌醇3-磷酸(phosphatidylinositol 3-phophate，PI3P)的产生，并在内质网-线粒体接触位点开始形成吞噬泡，完成吞噬体前体物质的合成。

两种独立泛素样连接系统(ubiquitin-like conjugation，UBL)控制ATG12-ATG5-ATG16L1复合物和(LC3-phosphatidylethanomine，LC3-PE)的产生，这对于吞噬泡的伸长和闭合至关重要。ATG16L复合物促进LC3-PE的形成，并将LC3-PE锚定在自噬体膜上。ATG4可解偶联一部分LC3-PE复合物，从而促进LC3的再循环，以形成新的自噬体。最终，在Rab7，syntaxin 17，囊泡相关膜蛋白8(vesicle-associated membrane protein 8，VAMP8)和溶酶体相关膜蛋白2(lysosome-associated membrane protein 2，LAMP2)等多种蛋白的参与下，自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体[8]。自噬溶酶体内容物被肽酶、脂肪酶和水解酶降解后再循环回细胞质。

2 细胞利用自噬抵抗胞内菌感染

2.1 异体自噬

巨自噬可分为选择性自噬和非选择性自噬。选择性自噬靶向特定的底物进行降解。根据选择性自噬降解的底物来划分，选择性自噬包括：聚集体自噬，脂噬，溶酶体自噬，线粒体自噬，过氧化物酶体自噬和异体自噬等[8]。其中异体自噬作为抵抗细菌感染的先天免疫机制，可以靶向胞内细菌以限制它们的生长。

当胞内菌逃逸到细胞质或含病原体的液泡(pathogen-containing vacuole，PV)受损时，暴露的微生物会被E3连接酶识别并泛素化[9-11]。随后，线性聚泛素体在细菌上沉积，诱导IKKα/IKKβ活化并最终激活NF-κB通路，促进促炎细胞因子的分泌以限制细菌生长[12-13]。除泛素化外，自噬受体NDP52还可与半乳糖凝集素8结合，半乳糖凝集素8是一种胞质凝集素，可在囊泡受损时识别暴露于胞质的β-半乳糖苷[14]。多种受体分子在细菌附近募集自噬蛋白以构建有利于自噬体形成的支架。

此外，细胞表面模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)识别并结合病原微生物特定的分子结构，激活下游信号通路，诱导异体自噬。Toll样受体(Tolllike receptors，TLRs)是一种经典的PRR，病原体激活TLRs后，髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)和β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)与Beclin-1相互作用，破坏Beclin-1与Bcl2的结合，从而诱导自噬的发生。核苷酸结合寡聚结构域蛋白1(nucleotide-binding oligomerization domain protein 1，NOD1)和NOD2是可识别细菌肽聚糖的胞内识别受体，可直接将ATG16L1募集至胞内病原体来诱导异体自噬发生[15]。而当胞内菌在细胞内过度繁殖引起细胞氨基酸缺乏时，细胞也可通过抑制mTOR触发异体自噬，限制胞内菌的生长。

2.2 LC3相关吞噬作用

在吞噬细胞的TLR或Fc受体介导的吞噬过程中，自噬组分(LC3，beclin-1，PtdIns3KC3和ATG12-ATG5)易位至吞噬体膜，促进吞噬体与溶酶体的融合。该过程不涉及双膜自噬体的形成，被称为LAP。LAP需要PI3K活性和LC3缀合机制，但与常规自噬不同，LAP依赖于由NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2，NOX2)和Rubicon产生的活性氧[16]，而不需要ULK1复合物。研究表明，LAP是抵抗多种病原体的有效宿主防御机制。例如，肺炎链球菌成孔毒素溶血素(pore-forming toxin pneumolysin，PLY)诱导小鼠巨噬细胞发生LAP，LAP可限制肺炎链球菌在细胞内的生长[17]。巨噬细胞通过LAP促进含单核细胞增生李斯特氏菌的吞噬体与溶酶体融合来清除单核细胞增生李斯特氏菌[18]。由此可见，LAP与异体自噬一样在微生物防御和维持细胞稳态中发挥重要作用。

2.3 非降解性自噬途径

异体自噬和LAP都涉及自噬囊泡的酸化，与溶酶体融合后内容物的降解。然而，近期研究表明，自噬在宿主防御中具有独立于溶酶体的功能，即通过非降解性自噬途径来清除宿主细胞内病原体。其主要包括：自噬蛋白靶向(targeting by autophagy proteins，TAG)的作用和分泌性自噬[19]。

TAG主要指的是LC3缀合系统将IFN诱导型GTP酶等免疫效应物募集至PV膜上，靶向破坏PV中的病原体，而此过程与溶酶体融合无关[20]。在干扰素激活的细胞中，LC3偶联系统将含有衣原体[21]的包涵体进行LC3标记，发动干扰素诱导型GTP酶、IRG酶和GBP酶靶向破坏LC3标记的包涵体。在分泌性自噬过程中，自噬蛋白和参与自噬底物靶向的三结构域(tripartite motif，TRIM)家族蛋白介导囊泡内病原体的清除。例如，致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli，UPEC)能够中和膀胱上皮细胞溶酶体的酸性坏境而避免被自噬靶向降解，宿主细胞为清除胞内病原体，通过活化自噬蛋白TRPML3启动溶酶体胞吐作用，诱导UPEC的排出，减少胞内细菌负荷[22]。因此，当自噬溶酶体降解被抑制时，分泌性自噬能够替代异体自噬发挥作用。

3 胞内菌逃逸宿主细胞自噬

依据胞内菌在宿主细胞外增殖的能力，可将胞内菌分为兼性胞内菌和专性胞内菌两类，其中兼性胞内菌可在宿主细胞外存活并复制。此外，最近研究发现，许多细胞外病原体，如金黄色葡萄球菌和大肠杆菌能够侵入哺乳动物细胞，在细胞内存活和繁殖[23]。为确保在宿主细胞内增殖，胞内菌需建立有效的策略来对抗细胞各种防御机制。针对自噬防御，细菌可通过以下几个方面来抑制或操控自噬：抑制自噬信号的诱导；抑制自噬体的形成；阻断自噬体与溶酶体的融合；利用宿主蛋白掩盖自身以逃避自噬识别和利用细胞自噬进行繁殖[24]。

3.1 抑制自噬起始

一些细菌通过抑制自噬信号传导逃避宿主自噬。例如，鼠伤寒沙门氏菌感染宿主后，依赖自身T3SS系统将宿主Sirt1，肝激酶B1和一磷酸腺苷激酶靶向溶酶体快速降解，导致mTOR被激活，抑制自噬的发生[25]。此外，鼠伤寒沙门氏菌效应因子SseF和SseG通过与宿主Rab1A GTP酶的相互作用抑制自噬起始。这种相互作用破坏了鸟嘌呤核苷酸交换因子与转运蛋白颗粒Ⅲ复合物的相互作用，阻碍了Rab1A的激活，从而抑制了ULK1的募集和激活[26]。结核分枝杆菌分泌的促存活因子(enhanced intracellular survival,EIS)能促进宿主组蛋白H3的乙酰化，导致IL-10的上调和mTOR活化，进而抑制自噬起始[27]。

3.2 抑制自噬体的形成

参与自噬体形成的核心自噬机制是自噬消除细胞内细菌所必需的，一些细菌通过直接干扰核心自噬机制来操纵自噬。嗜肺军团菌毒力因子RavZ通过水解LC3-PE中甘氨酸羧基与芳香族残基之间的酰胺键，产生不能被ATG7和ATG3重新缀合的LC3蛋白，抑制自噬体的形成[28]。此外，军团菌另一毒力因子Lpg1137可降解syntaxin 17，减少PI3P的形成，干扰自噬体的形成[29]。结核分枝杆菌可调节宿主细胞miRNA-155的表达，miRNA-155通过靶向人树突细胞中的ATG3，破坏LC3的脂化和自噬体的形成[30]。

3.3 阻断自噬体与溶酶体融合

自噬识别病原体后将其隔离在自噬体中，自噬体将病原菌转运至溶酶体降解清除。细菌为避免自噬杀伤，可阻断或延迟自噬体成熟为可降解的自噬溶酶体。例如，结核分枝杆菌效应物：磷酸酶SapM和激酶PknG抑制自噬体的成熟，促进结核分枝杆菌在宿主细胞中的存活和复制[31]。金黄色葡萄球菌通过激活MAPK14，将ATG5磷酸化，抑制自噬体与溶酶体的融合，使其在自噬体中复制后逃逸到细胞质中引起自噬依赖性细胞死亡[32]。除了影响自噬体与溶酶体的融合，直接影响溶酶体的正常功能也是病原菌干扰自噬的经典方式。副溶血弧菌三型效应蛋白VopQ能在溶酶体上形成离子通道，阻断自噬流，导致自噬体的累积[33]。

3.4 掩饰细菌表面逃避自噬识别

为了对抗宿主防御系统，细菌对含有病原体的吞噬泡进行修饰来逃避自噬识别。研究表明，弗氏志贺氏菌毒力因子IcsB可通过干扰自噬靶向分子与宿主蛋白Atg5的相互作用，以及对宿主带电多囊体蛋白5(charged multivesicular body protein 5，CHMP5)进行修饰，进而隐藏自身逃逸自噬[34-35]。肠道沙门氏菌去泛素化酶SseL可去除细胞对胞内沙门菌的泛素化修饰，影响受体蛋白p62的结合，抑制自噬对沙门菌的识别与清除[36]。此外，单核细胞增生李斯特氏菌毒力因子InlK和ActA蛋白共同作用，帮助单核细胞增生李斯特氏菌逃逸泛素识别和自噬靶向，其中，InlK将宿主主要拱顶蛋白募集至细菌表面，掩盖胞质内细菌的自噬识别，ActA蛋白则通过募集宿主细胞骨架蛋白至细菌表面来掩盖自身表面抗原[37]。

3.5 利用自噬进行自我复制

胞内寄生菌不仅能够干扰自噬的形成与识别，还能借助自噬以利胞内生长和感染，例如贝纳柯克斯体，土拉弗朗西斯菌等。大多数情况下，这些细菌主动诱导自噬，并阻断自噬体与溶酶体的融合，利用自噬体作为其生长的复制生态位[24]。贝纳柯克斯体是革兰氏阴性专性胞内菌，吞噬溶酶体内低pH环境有助于其生殖代谢。研究表明，贝纳柯克斯体空泡蛋白CvpF可特异性地与宿主GTP酶RAB26相互作用，将自噬体标记物LC3B募集到含贝纳柯克斯体的囊泡上，进而有利于贝纳柯克斯体的胞内存活[38]。土拉弗朗西斯菌感染小鼠胚胎成纤维细胞后，过度消耗细胞内营养物质，导致胞内氨基酸缺乏而诱导自噬，土拉弗朗西斯菌则利用该自噬过程降解宿主蛋白质产生氨基酸以维持自身生长和增殖[39]。

4 结语与展望

细胞自噬作为机体免疫防御的一部分，可通过异体自噬、LAP、非降解性自噬等途径清除胞内病原菌。但由于细胞自噬在进化过程中具有高度的保守性，胞内病原菌逐渐进化出不同逃逸宿主自噬的机制，主要包括干扰自噬信号传导、破坏自噬蛋白、利用毒力因子伪装细菌表面、模拟自噬组分修饰物将自噬蛋白募集到细菌囊泡上以促进其生长。尽管对于胞内病原菌和宿主细胞自噬之间的相互作用机制研究已取得较大进展，但仍有问题亟待解决。例如，到目前为止，大多数研究都基于细菌-宿主体外系统来阐明细菌干扰宿主自噬的机制，从而可能过度简化宿主先天反应，低估自噬与宿主其他信号通路之间的复杂交织。病原体与宿主细胞自噬之间的相互作用已成为近年来研究的热点，了解病原体与自噬相互作用的机制为药物设计和细菌感染的治疗提供理论依据。