肿瘤源性外泌体参与肿瘤转移的相关信号通路研究

罗静综述 马洪,胡赟审校

肿瘤转移占肿瘤相关死亡的90%[1]，转移是一个多步骤的过程。外泌体是一类细胞外囊泡，其主要作用是在机体细胞间传递信息，有助于肿瘤的发生和发展，包括正常细胞转化为恶性细胞及血管生成。外泌体可能诱导或促进肿瘤的形成，而肿瘤源性外泌体(tumour-derived exosomes，TDEs)是肿瘤细胞的首选信使，可促进转移等各种肿瘤内生物学过程，其通过直接激活信号通路如PI3K/AKT或MAPK/ERK等来促进肿瘤生长。肿瘤源性外泌体帮助肿瘤细胞调节其生长的微环境，更有利于肿瘤的发生和发展[2]。

1 外泌体结构

外泌体是活细胞分泌的最小类型的细胞外囊泡，几乎在所有体液中均可发现，包括血液、汗液、眼泪、尿液、唾液、母乳、腹水和脑脊液，直径为30～150 nm[3]。1981年在体外培养的绵羊网织红细胞上清液中首次发现被双层膜包围的小囊泡，并于1987年将这些细胞外囊泡命名为外泌体。外泌体由特定的分子特征定义，其常用分子标记是表面四分体，包括CD9、CD63、CD81及热休克蛋白(HSP60和HSP90)[4]。TDEs诱导分子特征，导致恶性细胞离开原发性肿瘤，并通过趋化作用促进肿瘤细胞向前哨淋巴结的迁移并建立了促进转移的支持环境。外泌体中的脂质成分包括鞘磷脂(SM)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、神经酰胺和胆固醇，这些脂质成分反映了产生它们的细胞类型，一般认为，来源于同一类型细胞的外泌体含有相似的蛋白质、核酸和脂质，而在癌细胞和非癌细胞分泌的外泌体中其所含的胆固醇和磷脂不同[5]。外泌体中包含各种核酸，如mRNA、microRNA(miRNA)、长非编码RNA(lncRNAs)及小干扰RNA(siRNA)，这些RNA不仅起基因表达调节剂的作用，还可以作为分泌因子调节细胞间通讯，在基于核酸和蛋白质分析的原发性和转移性肿瘤诊断中具有巨大的潜力[6]。随着对外泌体研究的不断深入，逐渐揭示其对细胞间通讯的重要作用，而细胞间通讯是肿瘤进展和转移的关键特征，其参与抗原呈递、细胞分化、生长、肿瘤免疫反应、肿瘤细胞的迁移和侵袭[7]；同时，其在肿瘤治疗中发挥重要作用。外泌体可以作为载体和生物标志物，参与细胞凋亡信号通路，降低化疗耐药性，从而在肿瘤治疗中发挥有益的作用。

2 肿瘤源性外泌体

大量的研究表明，miRNAs和lncRNAs在肿瘤的发展中起着重要的作用，其对肿瘤细胞的影响涉及多个方面，可通过多种模式由外泌体衍生或影响肿瘤细胞发育。外泌体lncRNAs有时会因1个miRNA家族的miRNA种子区域而富集，外泌体传递的非编码基因能够促进肿瘤细胞对肿瘤环境的适应和生存[8-9]。

TDEs微泡可释放到间质中，甚至直接进入淋巴管或进入肿瘤形成的假乳头状瘤中。此外，恶性肿瘤的新生血管被认为特别易渗漏，其通透性可能受外泌体、细胞因子等的影响。TDEs可促进各种肿瘤内生物学过程，帮助癌细胞调节其生长的微环境，更有利于肿瘤的发生和发展[2]。目前的证据表明，TDEs在转移的所有步骤中起重要作用。Li等[10]研究表明，miR-21来源于低氧细胞的外泌体，是上调最明显的miRNAs之一，其中外泌体miR-21以缺氧诱导因子(HIF)-1α和HIF-2依赖性方式显著增加卵巢鳞状细胞癌(OSCC)细胞迁移和侵袭。在相同条件下，肺癌细胞倾向于产生富含miR-23a的外泌体，促进血管生成，增加血管通透性，有利于肿瘤细胞的生长和转移[11]。乳腺癌细胞可以通过分泌携带高水平miR-122的囊泡，对小生境组织中的葡萄糖消耗进行重新编程，并促进转移。同时，大量研究表明，TDEs参与上皮间质转化(EMT)，其将信息从肿瘤传递到受体细胞，导致受体细胞的行为和微环境发生相关变化，其所涉及的机制十分复杂，因此，基于TDEs在EMT过程中所涉及的信号通路做一总结。

3 TDEs激活EMT参与相关信号通路

3.1 Wnt/β-catenin信号通路 人Wnt基因定位于12q13。在胚胎发育中，Wnt基因调控的重要信号传导系统称为Wnt通路。Wnt/β-catenin信号通路是Wnt通路中的一种，该途径会导致β-连环蛋白在细胞质中积累并最终会作为属于TCF的转录因子的转录共激活因子/LEF家族易位至细胞核。Wnt/β-catenin信号通路是诱导EMT最主要的通路之一，其中β-catenin是参与促癌途径的关键分子，Wnt/β-catenin作为肿瘤研究中最常见的靶点通路之一，常与TDEs相关，此外，Wnt/β-catenin信号通路还可激活EMT相关的转录因子，如Twist、Slug、Snail等[12]。lncRNA小核仁RNA宿主基因12 (SNHG12)是具有调控Wnt信号的替代靶基因，SNHG12通过Wnt/β-catenin 途径参与了食管鳞状细胞癌细胞的干细胞和EMT，SNHG12会使miR-6835-3p诱导Bmi-1并与胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白2(IGF2BP2) 相互作用以激活 Wnt/β-catenin途径[13]。Tang等[14]报道Wnt/β-catenin信号通路通过转录激活EMT和干细胞相关基因来增加EMT标志物。缺氧诱导的HCC细胞可释放外泌体miR-1273f，其通过激活Wnt/β-catenin信号通路增强常氧条件下肝细胞癌(HCC)细胞的EMT。lncRNA TIRY作为miRNA海绵，下调miR-14的表达，促进口腔癌EMT的发生[15]。有报道称，结直肠癌(CRC)细胞衍生的外泌体细胞环C1会激活Wnt/β-catenin信号通路，但其潜在的分子机制有待研究，此外，除了非编码RNA外，许多Wnt配体都是由TDE递送的。CRC细胞衍生的外泌体Wnt1可通过非匿名Wnt信号促进CRC细胞的增殖和迁移[16]。Wnt5a通过诱导外泌体的释放更积极地增强黑色素瘤，从而增加转移的可能性。CRC细胞衍生的外泌体Wnt4通过β-catenin在低氧条件下的核易位介导内皮细胞(ECs)的Wnt/β-catenin信号通路。同时，宫颈癌细胞外泌体能增强肿瘤细胞迁移和侵袭,调控增强Wnt/β-catenin信号通路中蛋白的表达[17]。因此，一些学者认为，TDEs中存在的Wnt配体可以作为有前途的治疗剂来控制癌细胞中EMT的诱导。

3.2 PI3K/Akt信号通路 磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)由2个亚基组成：一个p110催化亚基，一个p85调节亚基，具有SH2结构域，可结合活化的受体酪氨酸激酶(RTK)和多种细胞因子受体胞内段磷酸酪氨酸残基，被募集到质膜，使其催化亚基靠近质膜内小叶的磷脂酰肌醇。PKB与PKA、PKC均有很高的同源性，该激酶被证明是反转录病毒癌基因v-akt的编码产物，故又称Akt。PI3K在被激活后会产生多种与膜结合的PI-3-P，PKB可以利用其PH结构域结合到这些锚定位点上，进而完成下游信号的转导。PI3K/Akt是细胞中一个经典的信号通路，与磷脂酰肌醇有关，也是RTK介导衍生的信号通路。研究表明[18]，PI3K信号参与细胞分化、增殖和凋亡等多种功能的调节，激活PI3K信号后，PI3K可与下游分子Akt结合，发生膜转位进而磷酸化激活；提示PI3K/Akt信号通路参与调控癌细胞生长，抑制其相关蛋白表达可抑制癌细胞的恶性生物学行为。在不同的细胞类型中，如HEK293细胞、头颈部鳞癌细胞，当HRS的表达受到抑制时，外泌体的生物发生减少[19]。研究表明，Snail过表达促进了OSCC细胞中的EMT，OSCC细胞通过摄取源自癌相关成纤维细胞(caf)的miR-34a-5p缺失的外泌体，miR-34a-5p的转移还可通过AKT/GSK-3β/β-catenin/Snail信号级联效应影响OSCC细胞的增殖和运动能力，说明miR-34a-5p/AXL轴抑制剂可能是治疗口腔鳞状细胞癌的潜在疗法[20]。此外，外泌体lncRNA MALAT1可能通过调节岩藻糖基转移酶4(FUT4)相关的岩藻糖基化和PI3K/AKT/mTOR通路的激活，海绵化miR-26a/26b，从而增加CRC细胞的侵袭行为[21]。PI3K/Akt/mTOR轴为一种致癌信号通路，可调节多种细胞和分子活性，参与肿瘤形成、侵袭、转移和化疗耐药，而外泌体miR-21通过激活PTEN/PI3K/AKT信号通路而诱导淋巴管生成[22]。

3.3 MAPK/ERK信号通路 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，MAPK通路的基本组成是一种从酵母到人类都保守的三级激酶模式，包括MAPK激酶激酶(MKKK)、MAPK激酶(MKK)和MAPK，这3种激酶能依次激活，共同调节细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎性反应等多种重要的细胞生理/病理过程。在MAPK家族中，ERK蛋白亚家族在EMT中有重要作用[23]。MAPK通路是细胞增殖、应激、炎性反应、分化、功能同步化、转化、凋亡等信号转导通路的共同交汇通路之一，把胞外信号经受体、G蛋白/小G蛋白激酶、转录因子等组成的信号网络，传递到胞内，参与细胞增殖、分化、癌变、转移、凋亡等，不同的生长刺激、应激刺激，在不同的细胞，经不同细胞骨架局限的不同信号通路，可产生多种效应。来源于低氧OSCC细胞的外泌体含有miR-21，可增强OSCC细胞中Snail和波形蛋白的表达，但会降低E-cadherin的表达[10]。Qi等[24]的研究证实，间充质干细胞分泌的Exo可通过抑制p38和ERK磷酸化促进Akt磷酸化，抑制线粒体功能障碍引起的软骨细胞凋亡。Shen等[25]发现胰腺癌外泌体可转移至T淋巴细胞并与其整合，从而激活T淋巴细胞的p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路，在凋亡信号通路中非常重要。研究表明，miR-21在乳腺癌中通过AKT和ERK1/2途径靶向PTEN，从而促进EMT。此外，来源于高转移HCC细胞系MHCC97H的外泌体可以增加迁移、趋化和侵袭，通过MAPK/ERK信号途径诱导EMT对低转移HCC细胞的作用。低氧性肺腺癌细胞衍生的外泌体miR-31-5p靶向特殊的富含AT的序列结合蛋白2 (SATB2)，并通过激活MEK/ERK信号通路增强EMT[26]。骨髓间充质干细胞外泌体源性miR-30b-3p可通过调控肾癌细胞内胆固醇代谢关键酶CYP7A1的表达及MAPK/ERK信号通路以影响细胞胆固醇代谢,从而调控肾癌的发生发展[27]。

3.4 TGF-β/Smad通路 转化生长因子-β(TGF-β)信号通路在成熟有机体和胚胎中都参与了许多细胞过程，包括细胞生长、分化、凋亡，细胞动态平衡等其他细胞功能。TGF-β类配体与Ⅱ型受体结合，Ⅱ型受体招募并磷酸化Ⅰ型受体，Ⅰ型受体再磷酸化受体调控的SMAD蛋白(R-SMAD)，这些蛋白再与coSMAD结合，R-SMAD/coSMAD复合体作为转录因子在细胞核内聚集，参与目标基因表达的调控。SMAD家族中有2种抑制性蛋白(I-SMAD)，即SMAD6和SMAD7。它们参与负反馈调节，并在TGF-β信号通路的调控中起关键作用，它们有一个MH1结构域和一个MH2结构域，SMAD7与其他R-SMAD蛋白竞争，与Ⅰ型受体结合，并抑制其磷酸化。它们储存在细胞核中，一旦TGF-β被激活就进入细胞质并结合Ⅰ型受体。SMAD6与SMAD4结合，阻碍其他R-SMAD蛋白与coSMAD蛋白结合。有研究结果发现，肿瘤衍生的外泌体circPACRGL癌基因活性可影响CRC细胞生长、发育和转移。在一些关于癌症和发育相关EMT的研究中表明TGF-β是EMT诱导剂。Smad可以激活包括Snail1、Snail2、ZEB1、ZEB2和Twist1在内的转录因子，导致细胞间黏附的丧失和间充质标志物的获得[28]。外泌体miR-128-3p通过直接抑制其下游靶基因FOXO来激活TGF-β/SMAD和JAK/STAT3信号，从而调节EMT，并且miR-128-3p/FOXO4轴的性质通过外泌体递送水平转移[29]。研究表明，HCC衍生的外泌体在HCC治疗中显示出潜在的药物递送载体，其负载的外泌体可能通过灭活TGF-β/ Smad途径抑制EMT而起作用[30]。此外，circPACRGL通过miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1途径的表达，促进了CRC细胞的发育、侵袭、转移，以及N1向N2中性粒细胞的分化。外泌体介导的lncRNA ZEB1-AS1通过TGF-β/Smad途径促进miR-590-5p/ETS1轴对氧化低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞的细胞损伤[31]。通过调控肿瘤相关成纤维细胞的miR-181a，可影响结肠癌的增殖、侵袭能力,通过TGF-β/Smad通路调控结肠癌细胞EMT过程，明确过表达Smad7可促进结肠癌的恶性生物学行为[32]。这些研究表明，TGF-β可以促进EMT的进程。

4 小结与展望

大量研究证实了外泌体在癌症诊断中的作用。RNA和蛋白质分子参与形成有利的肿瘤微环境，促进肿瘤转移和血管生成。研究表明，外泌体的大小和数量与癌症之间存在相关性，而肿瘤源性外泌体miRNAs在癌症转移过程中起关键作用[33]。由于TDEs以各种方式促进肿瘤进展，外泌体在各种功能分子的分泌中具有重要作用，这些功能分子在CRC的发生发展中也具有重要作用。

尽管肿瘤源性外泌体具有多种潜在功能，但值得注意的是，其临床应用存在多种挑战和缺点。因此，还需要进行更多的研究，以增加对外泌体在肿瘤病理发生中作用的新认识，相信通过继续研究，未来充分利用外泌体作为天然载体的优势，同时避免其缺点，基于外泌体的癌症治疗技术将取得重大进展，使大量癌症患者受益。