颅内胶质瘤患者血清中微小RNA-34/194表达与患者生存期的相关性

王喜梅 单艳华 夏建华

颅内胶质瘤也称为脑胶质瘤[1]，患者生存率极低，即使目前临床上治疗脑胶质瘤的手段已有极大突破，但患者术后的生存率依旧未改善[2]。近年来，分子生物学在肿瘤的基因诊断和治疗方面有了重大突破，利用微小RNA(miRNA)研究新型靶向药物是目前的研究热点。miRNA可通过调节信号通路，对脑胶质瘤细胞增殖产生影响，如表皮生长因子受体(EGFR)通路、p53通路及转化生长因子(TGF)通路等[3]。miRNA在胶质瘤中表达上调或下调，对肿瘤细胞产生抑制或促进的作用[4]。miR-34在肿瘤细胞中呈较低的表达趋势，通过对p53信号通路的调控，发挥抑癌作用。miR-194在脑胶质瘤中的表达水平下调，对Bmil基因和CDH2蛋白的表达均有抑制，从而发挥抑癌的作用[5]。本研究主要探究颅内胶质瘤组织中miR-34、miR-194表达与患者生存期的相关性，报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取我院2014年6月至2018年6月收治的92例行胶质瘤切除手术的颅内胶质瘤患者作为研究组。纳入标准：①符合《脑胶质瘤诊疗规范(2018年版)》[6]中的诊断标准；②卡氏评分大于 80分；③第一次手术；④未经放化疗；⑤完成手术并出院。排除标准：①合并其他恶性肿瘤疾病；②合并自身免疫病；③患者资料不完整。选取同期64例行颅内减压术的非恶性肿瘤患者为对照组。研究组患者男性49例，女性43例；年龄31～80岁，平均年龄(54.29±3.61)岁；根据世界卫生组织(WHO)中枢神经系统肿瘤分类[7]，脑胶质瘤Ⅰ级7例，Ⅱ级36例，Ⅲ级29例，Ⅳ级20例。对照组患者男性38例，女性26例，年龄30～80岁，平均年龄(55.01±3.03)岁。2组研究对象性别、年龄等资料无统计学差异，具有可比性(P>0.05)。

1.2 方法

检查血清中miR-34和miR-194表达：采集研究组手术前后及对照组清晨空腹静脉血9 ml，离心15 min，3000 r/min，使用实时荧光定量PCR法检测血清中miR-34和miR-194的表达水平。操作步骤：取血清样本，采用mirVanaTMPARISTM试剂盒(Ambion-560)提取血清中的RNA总量，使用超微量核算蛋白测定仪(ND-2000)检测其RNA的浓度和纯度，利用DNAaseⅠ酶除去血清中的DNA，采用TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit试剂盒进行反转录。加入miR-34、miR-194引物，探针序列为：has-miR-34：UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU，has-miR-194：UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA。PCR反应体系：4.5 μL反转录产物，0.5 μL TaqMan mircoRNA assay(5×)，5.0 μL TaqMan Mix。PCR反应条件：95 ℃预热6 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min ，循环40次。采用相对定量法计算miR-34、miR-194相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 研究组手术前后及对照组血清中miR-34、miR-194的水平比较

研究组手术前血清中miR-34、miR-194水平均比对照组低(P<0.05)，手术后血清miR-34、miR-194水平均上升(P<0.05)，但仍低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 研究组手术前后及对照组血清中miR-34、miR-194水平对比

2.2 脑胶质瘤Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级患者手术后miR-34、miR-194水平比较

研究组患者根据WHO分级，将其分为脑胶质瘤Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级。92例脑胶质瘤患者术后组织中的miR-34表达水平的平均值为1.35，miR-194表达水平的平均值为1.24，以此作为标准，分为高表达组和低表达组。Ⅰ级患者中miR-34、miR-194均为高表达；Ⅱ级中miR-34高表达有29例，miR-194高表达有28例；Ⅲ级中miR-34高表达有2例、miR-194高表达有4例；Ⅳ级中均为低表达。见表2。

表2 脑胶质瘤Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级患者手术后miR-34、miR-194水平比较/例

2.3 研究组患者术后生存期情况

通过为期3年的随访发现，miR-34、miR-194高表达组患者术后6个月、1年、2年、3年生存率均高于低表达组(P<0.05)。见表3。

2.4 ROC曲线分析

经ROC曲线可得，miR-34、miR-194预测患者存活期的AUC分别为0.809、0.764，miR-34、miR-194的截断值分别为2.11、2.05，两者联合预测的AUC为0.882。见表4，图1。

3 讨论

胶质瘤是一种恶性的神经系统肿瘤，其中脑胶质瘤占其40%～60%，目前在临床上的治疗方法主要是肿瘤切除术、放化疗等[8]。由于该疾病具有较强的侵袭性，患者在手术后仍存在较高的复发可能性，患者的术后生存期仅有12～18个月。目前关于脑胶质瘤发生、进展的机制尚未明确，并且该肿瘤的生长呈浸润性，与正常组织无明显界限，无法通过常规影像学、血常规等检查方法诊断，因此探讨胶质瘤患者预后评估的相关内容具有意义[9]。已有大量研究发现，miRNA的表达水平发生改变，能对多种肿瘤的癌基因以及抑癌基因产生作用，其改变直接对细胞的增殖、分化及凋亡产生影响[10]。miRNA水平的升高或降低引起的抑癌或促癌作用，会对肿瘤患者的病理特征、诊断及预后产生影响。在胶质瘤中表达升高的miRNA可能与肿瘤的恶性程度及转移存在联系，而在胶质瘤中表达降低的miRNA可能发挥细胞功能调节的作用，对肿瘤生长和转移产生抑制[11]。表达下调的miRNA与肿瘤的临床诊断具有相关性，在预测疾病发展方面具有高灵敏度和高特异度，其可能成为新型的强效的抗癌药物，用以靶向治疗肿瘤[12]。

miRNA-34家族包含miR-34a、miR-34b、miR-34c，具有较高保守性，存在于不同物种中。目前有研究发现，miR-34a-c在多种恶性肿瘤中表达下降，是抑癌因子p53的转录靶点，参与调控了p53信号通路，发挥抑制肿瘤的作用[13]。抑癌因子p53能够抑制细胞的增殖，p53通路异常将引发多种肿瘤，其通过调节miRNA大方式去调节细胞的生长。癌基因、DNA损伤等刺激使p53信号通路活化，调节相关的miRNA，从而发挥抑癌作用。已有大量研究表明，p53激活的miRNA中包括了miR-34，miR-34是p53的靶基因，受到p53的直接调控，且还可以对p53的某些活性调节基因产生调控作用，参与p53的反馈调节[14]。关于miR-34家族的生物学功能研究，主要集中于抑制细胞生长、细胞凋亡及衰老的方面[15]。在哺乳动物的细胞中，miR-34与靶基因结合并抑制其表达，发挥促进细胞衰老的作用，因此miR-34有可能成为老化的一种生物标志物[16]。miR-34能够抑制细胞的增殖，在肿瘤发展进程中起着抑癌的作用，其在胶质瘤中的水平下降，是因为在启动子附近的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤岛甲基化，使miR-34失去活性，从而在胶质瘤中miR-34的表达水平呈下降趋势。在肿瘤细胞系中miR-34的表达水平下降，在恢复其表达后，肿瘤细胞的增殖和转移均受到抑制，表明miR-34产生抑癌作用并且抑制肿瘤细胞的侵袭作用[17]。已证实miR-34对p53通路调控而产生抑癌作用，越来越多的研究更关注于是否能将miR-34开发为一种新型靶向药物或检测肿瘤的临床手段。

miR-194在肺癌、肝癌等多种恶性肿瘤中也承担抑癌因子的作用，其在脑胶质瘤细胞系中表达水平下降，并且可以靶向调节b细胞特异单克隆鼠白血病毒整合位点基因-1(Bmi-1)，使该基因表达水平下降[18]。Bmi-1基因与神经干细胞、造血干细胞、白血病干细胞的更新和增殖有密切关系，能明显提高干细胞在机体内的生长和扩增水平。在脑胶质瘤细胞中，Bmi-1基因表达水平较高，能够促进肿瘤细胞不断更新，发展为癌症干细胞，Bmi-1还可以对肿瘤抑制基因产生负调控的作用，调控细胞的周期、凋亡及衰老。miR-194还与靶基因神经钙黏(CDH2)蛋白的表达水平存在相关性[19]。在脑胶质瘤中，CDH2基因呈高度表达，发挥促癌作用。miR-194在胶质瘤中低表达，并结合靶基因CDH2，降低CDH2基因的水平。miR-194在脑胶质瘤细胞中的表达明显低于正常脑组织细胞，若miR-194在细胞中过度表达，细胞的增殖能力显著下降[20]。也有迁移及侵袭实验表明，miR-194过度表达，细胞的迁移及侵袭能力均明显下降，而凋亡实验表明，miR-194过度表达，细胞的凋亡率也增加[21]。多项研究均表明，miRNA-34、miR194在脑胶质瘤细胞中发挥抑癌作用，可以作为新型靶向药物发展的靶点。

本研究结果显示，研究组患者手术前的miR-34、miR-194表达较低，经过手术肿瘤切除后，表达水平有所上升，但与对照组患者相比较，水平依旧偏低，说明miR-34、miR-194的表达与患者肿瘤的严重情况存在相关性。将研究组患者肿瘤分级，得到脑胶质瘤Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级，比较不同级别脑胶质瘤患者手术后的miR-34、miR-194的表达水平可以得到，脑胶质瘤级别越高，miR-34、miR-194的表达水平越低。根据miR-34的表达分为高表达组和低表达组，比较2组间的生存情况，结果表明miR-34表达越高，则患者的存活率越高。根据miR-194的表达也分为高表达组和低表达组，得到高表达组中6个月时有33例存活，1年有29例，2年有22例，3年有16例；低表达组中6个月有34例，1年有25例，2年有17例，3年有11例，表明miR-194表达越高，则患者的存活率也越高。比较组织中miR-34、miR-194的表达水平单独及联合预测颅内胶质瘤患者生存情况可得，将两个指标联合，可提高预测颅内胶质瘤患者生存期的特异度及灵敏度。

综上所述，颅内胶质瘤患者病情越严重，其血清中miR-34、miR-194的表达水平越低；且患者术后的miR-34、miR-194的水平越高，存活期越长。ROC曲线显示miR-34、miR-194的表达水平可以预测患者的生存期，且联合预测价值更高。