基于线粒体COⅠ基因滁州地区克氏原螯虾养殖群体遗传多样性分析

余红喜，刘 帆，朱国美，任信林，刘鑫鑫，凌武海，苏时萍*

(1.滁州市农业农村技术推广中心,安徽滁州 239000；2.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036)

克氏原螯虾(Procambarusclarkii)，隶属甲壳纲十足目螯虾科原螯虾属，俗称小龙虾。自20世纪30年代传入我国，在长江流域扩繁[1]，其味道鲜美，高蛋白低脂肪[2]，生命力顽强，适应性广，繁殖能力强，对水质要求不高，现已遍布于我国中东部地区十余省[3]，成为我国稻田养殖的主要品种，养殖面积总量大，产量居淡水虾类之首[4]。由于近几年克氏原螯虾养殖面积和规模不断扩大，受其逆向选择及种苗自繁自育的养殖模式等人为因素的影响，使得克氏原螯虾个头逐年变小，病害频发，种质退化严重，群体遗传多样性受到严峻考验[5]。为了恢复与保护克氏原螯虾种质资源，提供优良品种的选育科学依据，并提高经济效益，研究克氏原螯虾遗传多样性与遗传结构至关重要。

线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是保守的共价闭合的双链DNA分子，具有结构简单、进化速度快、无重组、多拷贝、母系遗传等特点。线粒体细胞色素氧化酶亚基I(COⅠ)作为蛋白编码基因的一员，在分子标记上是研究最为清楚的线粒体基因之一，也有学者认为，相比其他线粒体基因，COⅠ基因是更为理想和常用的分子标记[6]。徐浩文等[7]分析了8个地理种群红条毛肤石鳖COⅠ基因的遗传多样性，单倍型遗传多样性数据显示，多样性数值较高，核苷酸多样性较低，结果表明，红条毛肤石鳖北方群体的遗传多样性与南方群体存在差异，2个群体应该分别采取相应措施来保护遗传多样性；李大命等[8]基于线粒体COⅠ基因序列分析江苏省4个太湖新银鱼群体遗传多样性，结果表明4个太湖新银鱼种群偏离中性进化，历史上经历过种群扩张；刘士力等[9]分析了红螯螯虾养殖群体线粒体COⅠ基因序列的遗传结构，结果表明，5个红螯螯虾养殖群体的遗传多样性存在差异，群体间存在着一定的基因交流；轩中亚等[10]基于线粒体COⅠ序列分析中华绒螯蟹养殖群体与野生群体遗传多样性与遗传结构，发现野生中华绒螯蟹遗传多样性较低，尤其是在长江水系，不同地理群体之间的种质混杂情况较为严重，反映了过度捕捞对种质资源的极大破坏。然而，有关克氏原螯虾养殖群体线粒体COⅠ基因序列遗传多样性的研究鲜见报道。

安徽省滁州市稻田养殖克氏原螯虾至今已有25年，养殖群体分布广泛，也是最早开展克氏原螯虾苗种繁育的地区之一，以该地区为代表，研究克氏原螯虾养殖群体遗传多样性具有良好的代表性。笔者基于线粒体COⅠ基因序列，分析了安徽滁州市8个克氏原螯虾养殖群体的遗传多样性与群体结构，探究其养殖群体的遗传多样性现状，为更高效地开发利用安徽省克氏原螯虾种质资源及开展种质资源评估提供参考依据和科学指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料样品采自安徽省滁州市，分别为全椒县潘氏生态农业发展有限公司(F1)、全椒县赤镇龙虾经济合作社(F2)、全椒县金顺家庭农场(F3)、全椒县银花家庭农场(F4)、定远县曹永明家庭农场(F5)、定远锦鸿种养殖专业合作社(F6)、定远县成海家庭农场定远成海生态农场(F7)、定远县许令国生态种养殖家庭农场(F8)，共8个群体200个样本。取其背部肌肉组织置于95%乙醇中，4 ℃保存，用于线粒体DNA抽提。

1.2 试验方法

1.2.1线粒体DNA的抽提。肌肉组织使用YEASEN动物组织直接PCR试剂盒抽提DNA，-20 ℃保存。

1.2.2COⅠ序列的扩增、测序。COⅠ引物序列[11]：LCO1490:5′-GGTCAA CAAATCATAAAGATATTGG -3′;HC02198:5′- TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA -3′，委托上海桑尼生物科技有限公司进行引物合成。 PCR反应体系为40 μL，包括2×Tissue Direct PCR Mix 20 μL，20 mol/L上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O补足至 40 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30个循环；最后一个循环结束后，72 ℃延伸10 min。

PCR扩增产物经凝胶电泳初步确定片段长度后，由上海桑尼生物科技有限公司进行产物纯化、测序。

1.2.3遗传多样性和群体分化分析。序列的比对、碱基组成、遗传距离使用MEGAX[12]进行分析。序列的变异位点、核苷酸多样性(Pi)、单倍型多样性(Hd)、分化系数(FST)使用DNAsp 5.0[13]进行分析。

1.2.4群体结构分析。单倍型网络图使用POPART[14]构建。邻接法系统进化树使用MEGAX[12]构建，并进行1 000次的Bootstrap检验。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性和群体分化分析COⅠ测序数据经人工校正、比对、去除两端冗余序列和BLAST验证序列同源性后，共获得182条长度为655 bp的COⅠ序列用于下游分析，182条序列共检出25个变异位点，包括15个简约信息位点和10个单碱基变异位点；碱基平均含量为T(40.0%)，C(13.0%)，A(27.0%)和G(20.0%)，具有明显的(A+T)碱基偏倚。遗传多样性分析显示(表1)，多数群体具有较低的单倍型多样性(0.13 ～0.41 < 0.50)，仅F7组拥有较高的单倍型多样性(Hd=0.82)。核苷酸多样性与单倍型多样性趋势一致，但所有群体均较低。总体来说，8个群体整体呈现低单倍型多样性及低核苷酸多样性的遗传多样性现状。

表1 克氏原螯虾养殖群体的遗传多样性参数

群体分化分析显示(表2)，8个养殖群体间发生了不同程度的分化，从轻微分化(FST<0.05)到中等分化(0.05

表2 克氏原螯虾养殖群体的FST(对角线下)与群体间遗传距离(对角线上)

2.2 群体结构分析邻接法系统发育树分析显示(图1)，个体并未按照养殖群体地理位置分布聚集成相应的分支，反而混杂在一起，且个体间遗传距离较近。单倍型网络图显示(图2)，共检出26种单倍型，其中，Hap_1、Hap_2、Hap_4、Hap_7、Hap_15为多群体共享单倍型；Hap_2在群体共享单倍型中占主要分布，其余均为群体内独有单倍型；F7组群体拥有最多的单倍型(12个)。单倍型的分布方式与系统发育树趋势相同，并未依据地理位置而聚集，而是通过Hap_2替换数个碱基后相连接，多数单倍型为群体内部独有。

图1 克氏原螯虾养殖群体的邻接法系统发育树

注：圆圈面积大小代表单倍型频数，不同的颜色代表不同的群体，竖线代表突变位点

3 讨论

3.1 序列特征与遗传多样性分析COⅠ基因进化速度快，引物通用性强，碱基替换速率快，被广泛应用于群体遗传变异及系统进化等研究[15]。该研究共获得8个克氏原螯虾养殖群体182条，COⅠ区序列约为655 bp。碱基T、C、A、G 的平均含量为T(40.0%)，C(13.0%)，A(27.0%)和G(20.0%)，其中A+T(67.0%)高于C+G(33.0%)，呈现明显的AT碱基偏倚，符合脊椎动物线粒体碱基构成的一般特征[16]。

遗传多样性是生物适应与进化的物质基础，用于评价物种进化潜能与健康状况，丰富的遗传多样性使得物种能够更好地适应环境，拥有巨大的进化潜力。人工养殖的动物常因亲本基数不足，难以避免近交，产生奠基者效应，加速遗传漂变，使得遗传多样性迅速丢失。核苷酸多样性指数和线粒体DNA 的单倍型多样性指数是衡量DNA 多态程度的2个重要指标。8个群体的遗传多样性指数表现为较低的单倍型多样性(Hd=0.37)与较低的核苷酸多样性(Pi=0.001 72)，表明滁州地区的克氏原螯虾养殖群体遗传多样性较低，需要改良育种措施和育种方法。

3.2 遗传分化和群体结构群体间的遗传距离是衡量群体遗传分化的重要指标[17]。利用遗传距离数值定量估计了物种不同分类单位间的遗传分化水平，种群间遗传距离值为0～0.05，亚种间是0.02～0.20。该研究中8个克氏原螯虾群体间的遗传距离均在0.05 以下，且 MGEA软件聚类分析发现，8个群体均为混合聚类，说明8个群体之间的遗传分化处于群间水平。

群体遗传学研究认为，FST值可以表示群体间的分化程度，根据Wright[18]的划分标准可分为：0～0.05，无分化；>0.05～0.15，中度分化；>0.15 ～ 0.25，高度分化；>0.25，重度分化。该研究8个群体间的FST为-0.023 56～ 0.122 14，F7组与F1组群体间的遗传分化系数为0.122 14，表现为中度遗传分化；F6组与F8组群体间分化最弱。同样地，在单倍型网络图显示出与系统进化树相似的结果，8个群体的单倍型并未依照地理位置聚集，反而以Hap_2为主要共享单倍型，其余单倍型通过数个碱基的替换演变成群体内部独有单倍型。

4 结论

综上所述，该研究基于能够反映种群间遗传多样性的线粒体COⅠ为分子标记，分析了8个安徽省滁州市克氏原螯虾养殖群体的遗传多样性与群体结构。结果表明，8个群体的遗传多样性较低，群体结构为轻微程度的分化，群体间遗传 距离较小，不足以认定为群体间有差异。因此，在后续的繁殖与选育工作中，应当加强对遗传背景的筛查，避免因遗传背景的相似，造成克氏原螯虾遗传多样性的进一步丢失，进而影响克氏原螯虾养殖的经济效益。